如圖表示含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列,圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列.現(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG.請(qǐng)回答下列問(wèn)題:
(1)用圖1中的外源DNA(含有目的基因D)和圖2中的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和
.前者(酶)的專一性很強(qiáng),其作用特點(diǎn)是
.
(2)應(yīng)該使用限制酶BamHⅠ同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA,而不選擇其他3種,原因在于
.(多選) A.若使用SmaⅠ或者M(jìn)spⅠ會(huì)破壞目的基因.
B.若使用SmaⅠ切割質(zhì)粒,能成功切開(kāi)質(zhì)粒得到粘性末端的可能很低.
C.若使用MboⅠ切割質(zhì)粒,質(zhì)粒上會(huì)有2處被切開(kāi),會(huì)將質(zhì)粒切成兩段不利于篩選.
D.使用限制酶BamHⅠ能保證目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端,以便目的基因和運(yùn)載體定向連接,不至于反向連接.
E.使用BamHⅠ切割質(zhì)粒,質(zhì)粒上會(huì)有1處被切開(kāi),破壞抗生素A抗性基因,保留抗生素B抗性基因,以便于將來(lái)篩選含目的基因的受體細(xì)胞.
F.只有使用BamHⅠ切割,才能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端.
(3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T-A堿基對(duì)替換,那么基因D就突變?yōu)榛騞.從雜合子分離出圖1及其對(duì)應(yīng)的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,產(chǎn)物中共有
種不同DNA片段.若同時(shí)用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒,則可得到
個(gè)DNA片段.
(4)為了篩選出成功導(dǎo)入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌,一般可進(jìn)行如下步驟篩選:
第一步:將大腸桿菌在含
的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖3的菌落.
第二步:再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上,使絨布面沾上菌落,然后將絨布按到含
的培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到如圖4的結(jié)果(空圈表示與圖3對(duì)照無(wú)菌落的位置).
第三步:選出圖3培養(yǎng)皿中的某些菌落進(jìn)行培養(yǎng),即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌.請(qǐng)?jiān)趫D3中圈出含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落
以上篩選方式至少需要兩步,其實(shí)還有其他更簡(jiǎn)單的操作方法.請(qǐng)閱讀下列材料,回答問(wèn)題.
大腸桿菌pUC118質(zhì)粒的某限制酶唯一酶切序列,位于該質(zhì)粒的lacZ基因中.lacZ基因中如果沒(méi)有插入外源基因,便可表達(dá)出β-半乳糖苷酶.當(dāng)培養(yǎng)基中含有A物質(zhì)時(shí),A物質(zhì)便會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色,大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落;如果lacZ基因中插入了外源基因,帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達(dá)β-半乳糖苷酶,培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會(huì)被水解成藍(lán)色,大腸桿菌將形成白色菌落.pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因.如圖5是利用lacZ基因篩選重組質(zhì)粒示意圖.
(5)用圖5中的培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的受體大腸桿菌,制備時(shí)除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還應(yīng)加入物質(zhì)應(yīng)包括
(多選) A.伊紅美藍(lán)試劑 B.瓊脂 C.A物質(zhì) D.氨芐青霉素 E.四環(huán)素 F.噬菌體
(6)將上述處理后的大腸桿菌置于圖5中培養(yǎng)基上培養(yǎng),以檢測(cè)受體大腸桿菌是否導(dǎo)入重組質(zhì)粒,結(jié)果可能出現(xiàn)藍(lán)色或者白色菌落,其中
色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌.