Question

【題目】近年來，在處理富營養(yǎng)化水體的污水過程中，與化學、物理除氮方法比較，目前認為微生物反硝化去除氮素污染更為經(jīng)濟有效�？蒲泄ぷ髡卟捎没�因工程技術構建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，進行了相關研究。請回答問題。

（1）微生物的反硝化作用，是氮循環(huán)中一個重要的生物過程。亞硝酸鹽還原酶（Nir）是該過程的關鍵酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）轉錄后，再翻譯出具有___________作用的蛋白質。

（2）工程菌的構建

①研究者利用NCBI數(shù)據(jù)庫查到nirS基因的堿基序列，設計引物，利用PCR技術擴增nirS基因。PCR技術利用了___________的原理，使用耐高溫Taq酶而未使用普通DNA聚合酶的主要原因是______________________。

②研究者用HindⅢ和BamHI兩種限制酶處理nirS基因與p質粒，在_______________酶的作用下進行體外連接，用連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5，在含慶大霉素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并提取質粒，如果用HindⅢ和BamHI雙酶切，得到兩個片斷電泳結果分別與_______________電泳結果基本一致，說明獲得重組質粒pYP4S。

③將pYP4S轉化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培養(yǎng)后進行PCR鑒定。為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖1所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的最佳一對引物組合是_________。某學生錯選了圖中的另外一對引物組合，擴增出長度為2．1kb的片段，原因是_______________。

（3）檢測工程菌YP4S除氮的效能

①工程菌株YP4S在已滅菌的模擬污水中培養(yǎng)36h后，檢測結果如圖2。結果表明___________________。

②要進一步證明工程菌對含氮污水治理更有效，應___________________________。

Answer 1

【答案】催化 DNA復制 PCR過程中DNA在高溫下解鏈，這樣的高溫下，普通的DNA聚合酶的生物活性喪失 DNA連接 p質粒和插入片段（目的基因） 乙和丙 目的基因反向連接 工程菌株除氮效果優(yōu)于野生菌 Ⅰ．工程菌YP4S與野生菌分別處理實際污水36hⅡ．檢測除氮率

【解析】

分析題干可知：目前認為微生物反硝化去除氮素污染更為經(jīng)濟有效，科研工作者采用基因工程技術構建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，故需依據(jù)基因工程的相關原理進行分析作答。

（1）亞硝酸鹽還原酶（Nir）是該過程的關鍵酶，酶是經(jīng)基因的轉錄和翻譯過程形成的有催化作用的蛋白質。

（2）①PCR技術依據(jù)的原理是DNA分子的復制；因PCR過程中DNA解旋是在在高溫下進行的（90-95℃），這樣的高溫下，普通的DNA聚合酶的生物活性喪失，故在PCR技術中應采用使用耐高溫的Taq酶。

②連接兩個DNA片段所用的酶是DNA連接酶；因實驗中nirS基因與p質粒是分別用HindⅢ和BamHI兩種限制酶處理的，故若再用HindⅢ和BamHI雙酶切之后，得到兩個片斷電泳結果分別與p質粒和插入片段（nirS基因）電泳結果基本一致，可說明獲得重組質粒pYP4S。

③PCR技術要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結合，沿相反方向合成子鏈，結合目的基因的插入位置可知，PCR鑒定時應選擇的最佳一對引物組合是乙和丙；若某學生錯選了圖中的另外一對引物組合（甲和乙），只有反向連接后才能擴增出長度為2．1kb的片段 （2＋0.1kb）。

（3）①圖2結果表明，無論是總氮還是NH4＋、NO3—的去除率，工程菌株除氮效果優(yōu)于野生菌。

②因圖2是工程菌株YP4S在已滅菌的模擬污水中的處理結果，故要進一步證明工程菌對含氮污水治理更有效，應用工程菌YP4S與野生菌分別處理實際污水36h，檢測除氮率。