Question

19．將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)�入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力．如圖是與植物疫苗制備過(guò)程相關(guān)的圖和表．

表一引物對(duì)序列

引物對(duì)A	P1  AACTGAAATGTAGCTATC
	P2  TTAAGTCCATTACTCTAG
引物對(duì)B	S1　 GTCCGACTAGTGGCTGTG
	S2     AGCTGGCGTTTAGCCTCG

表二幾種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)表

限制酶	AluⅠ	EcoRⅠ	PstⅠ	SmaⅠ
切割位點(diǎn)	AG↓CT	G↓AATTC	CTGCA↓G	CCC↓GGG
	TC↑GA	CTTAA↑G	G↑ACGTC	GGG↑CCC

請(qǐng)根據(jù)圖表回答下列問(wèn)題．
（1）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是耐高溫．通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因前，需要根據(jù)這兩個(gè)基因的一段已知核苷酸序列來(lái)合成引物．
（2）PCR過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類(lèi)來(lái)設(shè)定．表1為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖2為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖．請(qǐng)判斷哪一引物對(duì)需采用較高的退火溫度？引物對(duì)B．
（3）圖1步驟③所用的DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿基序列是否有專(zhuān)一性要求？否．
（4）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟⑥轉(zhuǎn)基因所用的細(xì)菌B通常為農(nóng)桿菌．
（5）構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶分別作用于圖3中的aa 處（填“a”或“b”）．
（6）對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切．假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)，請(qǐng)根據(jù)圖1中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表2所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷．
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到2 種DNA片斷．
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到1 種DNA片斷．

Answer 1

分析 PCR技術(shù)是在體外對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所用的DNA聚合酶與體內(nèi)DNA聚合酶不同，是耐高溫的DNA聚合酶，過(guò)程為變性使DNA分子兩條鏈鈖旋開(kāi)來(lái)，復(fù)性是讓引物與DNA解旋開(kāi)來(lái)的單鏈互補(bǔ)配對(duì)，延伸是在DNA聚合酶的作用在引物引導(dǎo)下合成子代DNA分子．耐高溫的DNA分子中通常含有G與C堿基比例大，因?yàn)樗鼈冎�間形成三個(gè)氫鍵，而A與T之間只有兩個(gè)氫鍵．

解答 解：（1）PCR方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，需要進(jìn)行高溫解鏈過(guò)程，因此使用的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性．
（2）耐高溫的DNA分子中通常含有G與C堿基比例大，因?yàn)樗鼈冎�間形成三個(gè)氫鍵，穩(wěn)定性強(qiáng)．引物B中含C與G的堿基對(duì)較多，可采用較高的退火溫度．
（3）多種限制酶切割，形成不同的切割位點(diǎn)，所用的DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿基序列就沒(méi)有專(zhuān)一性要求．
（4）植物基因工程中，將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，因此常用農(nóng)桿菌做受體細(xì)胞．
（5）限制酶和DNA連接酶都作用于磷酸二酯鍵，即圖3中a處．
（6）據(jù)圖分析，用到了EcoR I酶和Alu I酶切割抗原DNA片段產(chǎn)生了X、Y兩個(gè)片段，而用EcoR I酶和SmaI酶切割質(zhì)粒產(chǎn)生了 M、N兩個(gè)片段，且M、N片段間存在Pst I酶切點(diǎn)．因此再用EcoRⅠ和PstⅠ酶切割這兩片段形成的重組質(zhì)粒，由于保留了Pstl的切割位點(diǎn)，所以可以得到兩種DNA分子，而用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切重組質(zhì)粒中，如圖I-②過(guò)程只能產(chǎn)生一種DNA片斷．
故答案為：
（1）耐高溫　引物 
（2）引物對(duì)B　
（3）否　
（4）農(nóng)桿菌　
（5）a    a 
（6）2 1

點(diǎn)評(píng) 本題具有一定的難度，考查了運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因的有關(guān)知識(shí)，意在考查考生的圖解識(shí)別能力，尤其是限制酶的作用是解答本題的難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)；能夠識(shí)記PCR技術(shù)中DNA聚合酶耐高溫的特點(diǎn)；識(shí)記DNA分子中C-G堿基對(duì)穩(wěn)定強(qiáng)．