Question

【題目】Ⅱ型干擾素是效應(yīng)T細(xì)胞分泌的一種淋巴因子，可用于治療病毒感染和癌癥�？茖W(xué)家將Ⅱ型干擾素基因與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行了重組，成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。

（1）若用PCR技術(shù)擴(kuò)增Ⅱ型干擾素基因，其前提條件是有一段______，以便根據(jù)這一序列合成引物。PCR過(guò)程需要經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括：加熱變形→冷卻復(fù)性→加熱延伸，其中冷卻復(fù)性的目的是______，加熱延伸過(guò)程中發(fā)生最主要的過(guò)程是______。

（2）已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)—↓GATC—，Ⅱ型干擾素基因結(jié)構(gòu)如圖中所示。

①在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，用限制酶______切割質(zhì)粒，用限制酶______切割目的基因。

②將得到的大腸桿菌涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖a所示的結(jié)果（圓點(diǎn)表示菌落），該結(jié)果說(shuō)明能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌中已導(dǎo)入了______。將滅菌絨布按到培養(yǎng)基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖b所示的結(jié)果（圓圈表示與圖a培養(yǎng)基上對(duì)照無(wú)菌落的位置）。與圖b圓圈相對(duì)應(yīng)的圖a中的菌落表現(xiàn)型是______，這些大腸桿菌中導(dǎo)入了______。

Answer 1

【答案】已知核苷酸序列的目的基因 便于引物與互補(bǔ)的DNA鏈的結(jié)合 在7075℃時(shí)，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶把單個(gè)脫氧核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接到引物上，如此逐漸延伸形成互補(bǔ)鏈 Ⅰ Ⅱ 普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒 抗氨芐青霉素但不抗四環(huán)素 重組質(zhì)粒

【解析】

1.獲得目的基因的方法：①?gòu)幕�因文�?kù)中獲取②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增③人工合成（化學(xué)合成）。PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。利用PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程由高溫變性(9095℃)、低溫復(fù)性(5560℃)、適溫延伸(7075℃)三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，在擴(kuò)增過(guò)程中離不開(kāi)Taq酶(熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)的催化。

2.將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因，且重組質(zhì)粒上的抗氨芐青霉素基因，也沒(méi)有被破壞，所以如果大腸桿菌B能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明已導(dǎo)入了含抗氨芐青霉素基因的普通質(zhì)�；蛑亟M質(zhì)粒，反之則沒(méi)有導(dǎo)入。

3.分析題圖：圖示表示利用基因工程培育工程菌的過(guò)程，圖中②表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，該過(guò)程需要限制酶和DNA連接酶；③表示將目的基因?qū)�入大腸桿菌的過(guò)程，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng)過(guò)檢測(cè)和篩選獲得工程菌。

（1）根據(jù)以上分析可知，用PCR技術(shù)擴(kuò)增Ⅱ型干擾素基因，其前提條件是有一段已知核苷酸序列的目的基因，以便根據(jù)這一序列合成引物。PCR過(guò)程冷卻復(fù)性(5560℃)的目的是便于引物與互補(bǔ)的DNA鏈的結(jié)合，加熱延伸過(guò)程中發(fā)生最主要的過(guò)程是在7075℃時(shí)，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶把單個(gè)脫氧核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接到引物上，如此逐漸延伸形成互補(bǔ)鏈，進(jìn)而使目的基因加倍。

（2）①在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需用限制酶對(duì)目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割以形成相同的黏性末端。質(zhì)粒如果用限制酶Ⅱ來(lái)切割的話，將會(huì)在質(zhì)粒在出現(xiàn)兩個(gè)切口且抗生素抗性基因全被破壞，故質(zhì)粒只能用限制酶Ⅰ切割（破壞四環(huán)素抗性而保留氨芐青霉素抗性，即將來(lái)形成的重組質(zhì)粒能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生存，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生存）；目的基因兩端都出現(xiàn)黏性末端時(shí)才能和質(zhì)粒發(fā)生重組，故目的基因只有用限制酶Ⅱ切割時(shí)，才會(huì)在兩端都出現(xiàn)黏性末端。

②因本題質(zhì)粒上有2個(gè)標(biāo)記基因，但抗四環(huán)素基因被插入的基因破壞掉，因此剩下的是抗氨芐青霉素抗性基因，如果在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，說(shuō)明已經(jīng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒或普通質(zhì)粒，因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒和重組質(zhì)粒都含有抗氨芐青霉素的基因。與圖2中b空圈相對(duì)應(yīng)的圖2的a中的菌落表現(xiàn)型是抗氨芐青霉素但不抗四環(huán)素，說(shuō)明這些細(xì)菌中導(dǎo)入了重組質(zhì)粒。