Question

【題目】正常細(xì)胞中含有抑癌的 P53 基因，能表達(dá)抗病毒蛋白，幫助修復(fù)輕度變異的基因，也能使重復(fù)變異的細(xì)胞發(fā)生凋亡而避免腫瘤的發(fā)生；若它失活而不能表達(dá)，則基因突變的細(xì)胞易形成腫瘤。基因治療腫瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖細(xì)胞和對人體基本無害而成為良好的基因載體。野生型腺病毒含有抑制 P53 基因活性的 55Kda 基因，以及病毒復(fù)制基因 E1，因此需要重新構(gòu)建有療效的、安全的腺病毒。圖甲、乙中箭頭所指為相應(yīng)限制酶切點(diǎn)。

（1）DNA 解旋酶直接作用于脫氧核苷酸之間的_____鍵（化學(xué)鍵）；限制酶直接作用于脫氧核苷酸之間的_____鍵（化學(xué)鍵）。

（2）構(gòu)建重組腺病毒時，限制酶最好選擇____，理由是：既可以去除_____基因以防止病毒復(fù)制后損傷健康細(xì)胞，同時還能破壞_____基因以防止其_____。

（3）在基因工程操作中，檢測目的基因是否發(fā)揮功能的第一步是_____，檢測方法是____技術(shù)，若出現(xiàn)雜交帶，則表明成功。

（4）如果需將目的基因利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 10 次，則需要在緩沖液中至少加入____個引物。A．210B．210+2 C．211D．211-2

（5）PCR 擴(kuò)增目的基因的前提是_____，以便根據(jù)這一序列合成引物。PCR 需提供_____， 引物，dNTP，DNA 模板。反應(yīng)結(jié)束后，可以利用 DNA 的_____特點(diǎn)進(jìn)行 DNA 含量的測定。

Answer 1

【答案】氫 磷酸二酯鍵 BamHI 和 EcoRI E1 55kda 抑制 P53 基因的活性 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出 mRNA 分子雜交 D 有一段已知目的基因的核苷酸序列 Taq 酶 DNA 在 260nm 的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰

【解析】

分析題圖：圖甲為野生型腺病毒DNA，其中含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒復(fù)制基因E1，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時應(yīng)破壞或去除55Kda基因和基因E1；

圖乙為人體DNA片段，其中P53基因?yàn)槟康幕�因．要獲得目的基因（P53基因），同時還要破壞或去除55Kda基因和基因E1，應(yīng)選用EcoRI和BamHI切割載體和含有目的基因的DNA。

（1）DNA 解旋酶直接作用于脫氧核苷酸之間的氫鍵，使DNA的雙鏈解開螺旋；限制酶直接作用于脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（2）根據(jù)題干信息“野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒復(fù)制基因E1”可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時，應(yīng)選用EcoRI和BamHI切割載體和含有目的基因的DNA，這樣既可以去除E1基因以防止病毒復(fù)制后損傷健康細(xì)胞，同時還能破壞55Kda基因以防止其抑制P53基因的活性。

（3）在基因工程操作中，檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步是檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，檢測方法是分子雜交技術(shù)，用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。

（4）利用PCR技術(shù)將目的基因擴(kuò)增N次，至少需要的引物2N+1-2個，如果需將目的基因利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 10 次，則需要在緩沖液中至少加入211-2個引物，故選D。

（5）PCR 擴(kuò)增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。PCR 需提供Taq 酶，引物，dNTP，DNA模板。反應(yīng)結(jié)束后，可以利用 DNA 的DNA 在 260nm 的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰特點(diǎn)進(jìn)行 DNA 含量的測定。