Question

【題目】下圖為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點。

據(jù)圖回答：

（1）將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI 酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有_______________、_____________、__________三種。若 要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質粒，需要對這些連接產(chǎn)物進行____________。

（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是_________；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是_________。

（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是_________，其合成的產(chǎn)物是_________。

（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應選用的酶是_______。

Answer 1

【答案】目的基因—載體連接物 載體—載體連接物 目的基因—目的基因連接物 分離純化 載體—載體連接物 目的基因—載體連接物、載體—載體連接物 啟動子 mRNA EcoRI和BamHI

【解析】

用上述兩種限制酶同時切割目的基因后，目的基因的兩個黏性末端不同，這樣目的基因就不會自連成環(huán)狀。同樣用上述兩種限制酶同時切割質粒后，質粒的兩個黏性末端也不同，這樣質粒也不會自連。這樣當把切割后目的基因和切割后質�；旌虾螅�只有目的基因和質粒才能相連。產(chǎn)物中只有重組質粒，而無其他的連接產(chǎn)物。

（1）用EcoRI酶切出的目的基因和質粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA連接酶，則可出現(xiàn)三種連接結果，即會出現(xiàn)目的基因自身形成的連接物，載體自身形成的連接物和重組質粒，要通過篩選、純化才能選出符合要求的DNA。

（2）載體自身形成的連接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四環(huán)素的特點，其他連接物中tetR基因被限制性內(nèi)切酶破壞，不再具有抗四環(huán)素的特點；在整個操作過程中，ampR基因保持完整，質粒自身形成的連接物和重組質粒都具有抗青霉素的特性。

（3）RNA聚合酶與相關基因的啟動子結合，完成的是轉錄過程。

（4）將含有目的基因的靶DNA片段和載體分別用兩個不同的限制性內(nèi)切酶切割，使兩種DNA片段自身的5′和3′黏性末端不同，但二者相同末端又互補，這明顯減少靶DNA片段和載體自身環(huán)化與串連，使外源DNA片段能正確插入載體啟動子下游。在本題中目的基因兩端有EcoRI酶切點和BamHI酶切點，在質粒載體上也有這兩種酶的切點，所以可以用這兩種酶切出非同源性互補末端來阻止其他連接。