Question

目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖一所示。

（1）建構(gòu)基因表達(dá)載體時(shí)，必須有               、復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、終止子以及                                    。

（2）構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于                    。

（3）pBR322分子中有單個(gè)EcoRI限制酶作用位點(diǎn)，EcoRl只能識(shí)別序列—GAATTC一，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRl的切點(diǎn)，請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端                   。

（4）pBR322分子中另有單個(gè)的BamHI限制酶作用位點(diǎn)，現(xiàn)將經(jīng)BamHI處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復(fù)         ，成功獲得了重組質(zhì)粒。說明                         。

（5）為了檢測(cè)上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無amp^R和tet^R的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果（空圈表示與圖二對(duì)照無菌落的位置）。與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是            。圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是                 。

Answer 1

（1）啟動(dòng)子  植物體細(xì)胞雜交  標(biāo)記基因（可互換位置）

（2）篩選（鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞）。

（3）

（4）磷酸二酯    兩種限制酶（BamHI和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（5）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素        pBR322質(zhì)粒

【解析】作為運(yùn)載體的質(zhì)粒，應(yīng)該具有標(biāo)記基因，以利于鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，還應(yīng)該具有啟動(dòng)子和終止子，以利于目的基因的表達(dá)。限制酶的作用是切出黏性末端，連接酶的作用是催化3，5一磷酸二酯鍵的形成。既然經(jīng)BamHI處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用能恢復(fù)3，5一磷酸二酯鍵，則說明BarnHI和BglⅡ切割得到的黏性末端相同。實(shí)驗(yàn)由圖二進(jìn)行到圖三，相當(dāng)于應(yīng)用了“孢子印”。如果圖三的培養(yǎng)基與圖二中的一樣，則圖三中的結(jié)果理應(yīng)與圖二一樣。出現(xiàn)圖三中的空圈，說明了圖三中的四環(huán)素對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生了毒害作用，也就說明了該種大腸桿菌無抗四環(huán)素的能力。