Question

5．圖1表示含有目的基因D的DNA片段及其中部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列．現(xiàn)有MpsⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶．它們識別的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．現(xiàn)要培育含目的基因D的大腸桿菌，請回答下列問題：

（1）為了提高試驗成功率，需要通過PCR擴(kuò)增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝，該過程除需目的基因和dNTP （包括dATP、dGTP，dCTP、dTTP）之外還需提供熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）和引物．
（2）圖2中，啟動子的作用是與RNA聚合酶結(jié)合，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA．
（3）分別用4種限制酶切割圖1中的DNA片段，能形成黏性末端的是MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ．
（4）若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是BamHⅠ．為了提高重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌的成功率，需將大腸桿菌用Ca²⁺進(jìn)行處理．
（5）為了篩選出成功導(dǎo)入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，首先將大腸桿菌圖3所示的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖3的菌落．再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到圖4所示的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖4的結(jié)果（空圈表示與圖3對照無菌落的位置）．請推測：圖3和圖4培養(yǎng)基里含的抗生素分別是抗生素B，抗生素A．圖4中生長的大腸桿菌中是否有目的基因D？不含．

Answer 1

分析 分析圖一：圖中DNA片段含有2個限制酶SmaⅠ切割位點，可被限制酶SmaⅠ切割產(chǎn)生長度為534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三中DNA片段．質(zhì)粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環(huán)抗生素B抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

解答 解：（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因需要以目的基因為模板，以四種脫氧核苷酸作為原料，同時還需要熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）和引物．
（2）啟動子的作用是與RNA聚合酶結(jié)合，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA．
（3）根據(jù)題干中提供的限制酶識別序列和切割位點可知，目的基因上均存在四種限制酶的識別序列，但是SmaⅠ限制酶切割得到的是平末端，其它三種酶切割得到的是黏性末端．
（4）由圖1可知，目的基因兩側(cè)是GGATCC序列，該序列是限制酶BamHⅠ的識別序列，因此要將質(zhì)粒和目的基因D連接形成重組質(zhì)粒，應(yīng)選用限制酶BamHⅠ切割．為了提高重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌的成功率，需將大腸桿菌用Ca²⁺進(jìn)行處理，使大腸桿菌變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞．
（5）用限制酶BamHⅠ切割質(zhì)粒后，用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環(huán)抗生素B抗性基因，因此首先用含有抗生素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，能生存下來的是含有普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌；再用含有抗生素A的培養(yǎng)基培養(yǎng)，能生存下來的是含有普通質(zhì)粒的大腸桿菌，即圖4中生長的大腸桿菌不含目的基因D．
故答案為：
（1）熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）和引物
（2）與RNA聚合酶結(jié)合，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA
（3）MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ
（4）BamHⅠCa²⁺
（5）抗生素B　  抗生素A　 不含

點評 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，能結(jié)合圖中限制酶的識別序列判斷所選限制酶的種類，再根據(jù)抗性基因進(jìn)行篩選，同時能結(jié)合圖中和題中的數(shù)據(jù)答題．