Question

【題目】某些膜內(nèi)蛋白以緊密排列的方陣形式存在稱為OAPs，OAPs的分布異常與某些神經(jīng)性和神經(jīng)肌肉性疾病相關(guān)。研究AQP4（一種水通道蛋白）與OAPs結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系，有助于揭示上述疾病的機制。請回答問題：

(1)AQP4有M1和M23兩種分子量相近的亞型，二者均可獨立構(gòu)成四聚體發(fā)揮作用。科研人員發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入并穩(wěn)定表達M23基因的細胞，其細胞膜上有OAPs形成，而敲除該基因的細胞中未見OAPs的形成，該結(jié)果表明______。

(2)科研人員繼續(xù)對M1與OAPs形成的關(guān)系進行了研究。

①提取大鼠腦組織的總RNA，通過______法獲得cDNA，并通過______技術(shù)獲得M1基因。

②將M1基因與質(zhì)粒用______酶構(gòu)建基因表達載體，導(dǎo)入中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中，用______技術(shù)檢測到受體細胞已成功表達M1蛋白。

③科研人員繼續(xù)實驗，方案及結(jié)果如下。

實驗分組	1對照組	2對照組	3實驗組
實驗處理	a	b	導(dǎo)入M1基因的CHO細胞
	培養(yǎng)一段時間后裂解細胞并離心，取上清液中蛋白
檢測指標	用電泳技術(shù)檢測 c 的形成情況

請將表格中的實驗方案補充完整。a：______，b：______，c：______。

(3)綜合上述實驗結(jié)果，AQP4與OAPs形成的關(guān)系為______。

Answer 1

【答案】M23可促進細胞膜上OAPs聚集 ①逆轉(zhuǎn)錄 PCR ②限制酶和DNA連接酶 抗原抗體雜交 導(dǎo)入M23基因的CHO細胞 導(dǎo)入空質(zhì)粒的CHO細胞 OAPs M1與OAPs的形成無關(guān)，M23與OAPs的形成有關(guān)

【解析】

1、基因工程的操作過程

(1)目的基因的獲取

①從基因文庫中獲取

基因文庫包括：基因組文庫和部分基因文庫(其中的cDNA文庫是利用反轉(zhuǎn)錄法獲取的)。

②利用PCR技術(shù)擴增

a.變性(90～95℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈。

b.復(fù)性(55～60℃)：引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

c.延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的子鏈。

d.循環(huán)重復(fù)上述過程，n次循環(huán)后，目的基因的量將被擴增2n倍。

③利用化學(xué)方法人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知時，選擇該方法。

(2)基因表達載體的構(gòu)建

①通常用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，然后用DNA連接酶將二者連接，改造后成為基因表達載體。

②組成：目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復(fù)制原點。

(3)將目的基因?qū)�入受體細胞

生物種類	植物	動物	微生物
常用方法	農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法	顯微注射技術(shù)	感受態(tài)細胞法
受體細胞	體細胞或受精卵	受精卵	原核細胞
轉(zhuǎn)化過程	將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達	將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物	Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA 分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子

(4)目的基因的檢測與鑒定

①分子水平的檢測

a．利用DNA分子雜交技術(shù)檢測目的基因的有無。

b．利用分子雜交技術(shù)檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄。

c．利用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測目的基因的翻譯。

②個體生物學(xué)水平的鑒定，如抗蟲、抗病的接種實驗等。

(1)題干提到“導(dǎo)入并穩(wěn)定表達M23基因的細胞，其細胞膜上有OAPs形成，而敲除該基因的細胞中未見OAPs的形成”，該結(jié)果表明M23可促進細胞膜上OAPs聚集。

(2)由基因工程的操作過程可知：

①提取大鼠腦組織的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA，并通過PCR技術(shù)獲得M1基因。

②將M1基因與質(zhì)粒用限制酶和DNA連接酶構(gòu)建基因表達載體，導(dǎo)入中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中，用抗原—抗體技術(shù)檢測到受體細胞已成功表達M1蛋白。

③由（1）可知M23可促進細胞膜上OAPs聚集，由此設(shè)計實驗方案：

實驗分組	1對照組	2對照組	3實驗組
實驗處理	導(dǎo)入M23基因的CHO細胞	導(dǎo)入空質(zhì)粒的CHO細胞	導(dǎo)入M1基因的CHO細胞
	培養(yǎng)一段時間后裂解細胞并離心，取上清液中蛋白
檢測指標	用電泳技術(shù)檢測OAPs的形成情況

實驗電泳圖表明M1不能促進細胞膜上OAPs聚集。

(3)由于AQP4有M1和M23兩種分子量相近的亞型，二者均可獨立構(gòu)成四聚體發(fā)揮作用，經(jīng)實驗表明M23可促進細胞膜上OAPs聚集，M1不能促進細胞膜上OAPs聚集，因此可得，M1與OAPs的形成無關(guān)，M23與OAPs的形成有關(guān)。