Question

11． Rag₂基因缺失小鼠不能產生成熟的淋巴細胞．科研人員利用胚胎干細胞（ES細胞）對Rag₂基因缺失小鼠進行基因治療．其技術流程如圖：

（1）步驟①中所選的卵母細胞應處于減數(shù)第二次分裂中（MⅡ中）期．
（2）步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到囊胚期時，可從其內細胞團分離出ES細胞，ES細胞在形態(tài)上表現(xiàn)為細胞體積小，細胞核大，核仁明顯的特點．
（3）步驟③中，需要構建含有Rag₂基因的表達載體（重組質粒）．可以根據Rag₂基因的核苷酸序列設計合成引物，利用PCR技術擴增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在目的基因所在DNA片段兩側進行酶切獲得Rag₂基因片段．為將該片段直接連接到表達載體，所選擇的表達載體上應具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位點．
（4）為檢測Rag₂基因的表達情況，可提取治療后小鼠骨髓細胞的蛋白質，用抗Rag₂蛋白的抗抗體進行抗原-抗體雜交．

Answer 1

分析 分析題圖：圖示是利用胚胎干細胞（ES細胞）對Rag₂基因缺失小鼠進行基因治療的過程圖解，其中①表示核移植過程，②表示早期胚胎培養(yǎng)過程，③表示采用基因工程技術將目的基因導入受體細胞．

解答 解：（1）步驟①核移植中所選的卵母細胞應處于減數(shù)第二次分裂中期．
（2）胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內細胞團）．故步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到囊胚期時，可從其內細胞團分離出ES細胞，ES細胞在形態(tài)上表現(xiàn)為細胞體積小，細胞核大，核仁明顯的特點．
（3）步驟③中，需要構建含有Rag₂基因的表達載體；設計引物要遵循堿基互補配對原則，所以根據Rag₂基因的核苷酸序列進行設計；利用PCR技術可在體外大量擴增目的基因；Rag₂基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割獲得的，所以表達載體應具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位點．
（4）基因表達的產物是蛋白質，所以提取小鼠骨髓細胞的蛋白質進行抗原-抗體雜交．
故答案為：
（1）減數(shù)第二次分裂中（MⅡ中）
（2）內細胞團    細胞體積小，細胞核大，核仁明顯
（3）表達載體（重組質粒）    引物     PCR　  HindⅢ和PstⅠ
（4）抗原-抗體雜交

點評 本題結合圖解，綜合考查基因工程、細胞工程和胚胎工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節(jié)問題；識記核移植的具體過程；識記體外受精的具體過程及早期胚胎發(fā)育的過程，能結合所學的知識準確答題．