Question

【題目】pBV220質(zhì)粒是被廣泛應(yīng)用的大腸桿菌載體，結(jié)構(gòu)如下圖所示。其中PRPL是啟動子，rrB是基因轉(zhuǎn)錄終止信號，Ampr是氨芐青霉素抗性基因，ori是質(zhì)粒復(fù)制起點，EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、Pst Ⅰ均為限制性內(nèi)切酶。回答下列問題：

（1）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有________________。

（2）將目的基因與此質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體時，通常用圖中____________兩種限制酶切割此質(zhì)粒，其優(yōu)點是______________________。用這兩種酶可以切開此質(zhì)粒的_____個磷酸二酯鍵，并且會____（填“消耗”或“產(chǎn)生”）同樣數(shù)量的水分子。

（3）將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前，需用__處理大腸桿菌，使之成為________細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)化效率。目的基因是否成功導(dǎo)入大腸桿菌，可采用___________進(jìn)行檢測。

Answer 1

【答案】 具有多個限制酶的切割位點、具有標(biāo)記基因 EcoRⅠ、Hind Ⅲ 防止質(zhì)粒切割后自身環(huán)化 4 消耗 Ca2+ 感受態(tài) DNA分子雜交技術(shù)

【解析】試題分析：基因工程技術(shù)的基本步驟：
1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）從圖中可看出，pBV220作為運載體具備的條件有具有多個限制性內(nèi)切酶的切割位點（便于目的基因的插入）、標(biāo)記基因（便于鑒定和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞）。

（2）將目的基因與此質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體時，通常用圖中EcoRⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割此質(zhì)粒，這兩種酶切割產(chǎn)生的末端不同，可以防止質(zhì)粒切割后自身環(huán)化。用這兩種酶可以切開此質(zhì)粒的4個磷酸二酯鍵，同時且消耗4個水分子。

（3）基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌前，需用Ca2+處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)化效率。目的基因是否成功導(dǎo)入大腸桿菌，可采用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行檢測。