Question

【題目】乳糖酶是一種生物酶制劑，主要用來治療乳糖不耐受癥。研究人員利用基因工程技術(shù)，將人工優(yōu)化的米曲霉乳糖酶基因（lacA）導(dǎo)入乳酸克魯維酵母細(xì)胞，獲得了高效表達(dá)乳糖酶的重組菌株。下圖1為載體PKLACl的限制酶切圖譜（總長度為9091bp，bp表示堿基對；XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶，數(shù)字代表堿基的編號），amdS基因編碼的乙酰胺酶能夠?qū)⒁阴０方到獬砂�，只有轉(zhuǎn)化成功的乳酸克魯維酵母才能在乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長。圖2為含有lacA的DNA片段。

請回答下列問題：

（1）米曲霉合成并分泌至胞外的乳糖酶能將乳糖分解為________。

（2）優(yōu)化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C堿基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳酸克魯維酵母偏愛的密碼子出現(xiàn)的頻率大幅度增加，從而在不改變?nèi)樘敲?/span>________序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達(dá)中________（填具體步驟）的效率。

（3）將優(yōu)化的米曲霉乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用用XhoⅠ、BelⅡ雙酶切，然后用________連接,得到含目的基因的重組質(zhì)粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為________bp.

（4）用小劑量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，對所提取的重組質(zhì)粒用SacⅡ單酶切后純化，純化產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳檢測。若結(jié)果如圖3中的第________（填序號）泳道所示，則說明優(yōu)化后的目的基因片段lacA成功構(gòu)建在質(zhì)粒pKLACl中。

（5）將重組質(zhì)粒pKLACl-lacA用SacⅡ單酶切使其線性化，純化后與感受態(tài)乳酸克魯維酵母細(xì)胞混合、轉(zhuǎn)化。用________適當(dāng)稀釋細(xì)胞液，均勻地涂布于________平板上進(jìn)行培養(yǎng)，富集并篩選重組菌株。將篩選出的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)120h，檢測________，最終獲得高效表達(dá)乳糖酶的重組菌株。

Answer 1

【答案】葡萄糖和半乳糖 氨基酸 翻譯 DNA連接酶 2982 1、3 無菌水 以乙酰胺作為唯一氮源 乳糖酶活性/活力

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣，將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)，個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）乳糖由葡萄糖和半乳糖組成，故乳糖酶能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。

（2）乳糖酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，優(yōu)化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C堿基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳酸克魯維酵母偏愛的密碼子出現(xiàn)的頻率大幅度增加，從而在不改變?nèi)樘敲赴被�酸序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達(dá)中翻譯的效率。

（3）乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用XhoⅠ、BelⅡ限制性酶酶切，然后用DNA連接酶連接，得到含目的基因的重組質(zhì)粒。題干信息可知，載體PKLACl的限制酶切圖譜總長度為9091bp，含目的基因的重組質(zhì)粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為12040909133=2982bp。

（4）重組質(zhì)粒，用SacⅡ單酶切后，形成兩個(gè)大小不同的DNA片段，結(jié)合圖3，M是marker組，1、2、3號是酶切組，對比分析結(jié)果第1、3泳道所示，說明優(yōu)化后的目的基因片段lacA成功構(gòu)建在質(zhì)粒pKLACl中。

（5）防止污染用無菌水適當(dāng)稀釋細(xì)胞液，均勻地涂布于以乙酰胺作為唯一氮源平板上進(jìn)行培養(yǎng)，富集并篩選重組菌株。將篩選出的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)120h，檢測乳糖酶活性/活力，最終獲得高效表達(dá)乳糖酶的重組菌株。