Question

【題目】蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對(duì)人體沒有影響。我國科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關(guān)研究。

（1）研究者用相同的_________酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)_________處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。

（2）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），并按圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。

①這是一種定點(diǎn)的_________技術(shù)。

②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請(qǐng)?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。_____

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1
PCR2
PCR3
PCR4

（3）研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和_________分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用_________方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較_________的大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點(diǎn)是_________。

Answer 1

【答案】限制酶和DNA連接 CaCl2 基因突變

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒） 抗原-抗體雜交 抑菌圈 對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全；不會(huì)造成基因污染；有效成分純度較高

【解析】

（一）基因工程的基本工具

1、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）

（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。

（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。

（3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。

2、“分子縫合針”——DNA連接酶

（1）兩種DNA連接酶（EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：

①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。

②區(qū)別：EcoliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率較低。

（2）與DNA聚合酶作用的異同：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵．DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。

3、“分子運(yùn)輸車”——載體

（1）載體具備的條件：①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。

②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。

③具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

（2）最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

（3）其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。

（二）基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的獲取

1、目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。

2、原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制

（2）過程：第一步：加熱至90～95℃span>DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。

第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

2、組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因

（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。

（2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。

（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來．常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。

第三步：將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞

1、轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

2、常用的轉(zhuǎn)化方法：

將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和 花粉管通道法等。

將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是 顯微注射技術(shù)．此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。

將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：原核生物作為受體細(xì)胞的原因是 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，最常用的原核細(xì)胞是 大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化方法是：先用Ca2+處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。

3、重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)

1、首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。

2、其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用用標(biāo)記的目的基因作探針與 mRNA雜交。

3、最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原——抗體雜交。

4、有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定，如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。

（1）在基因工程中，利用相同的限制酶和DNA連接酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒；大腸桿菌作為受體細(xì)胞，需要用氯化鈣處理，以便重組質(zhì)粒的導(dǎo)入。

（2）①根據(jù)題意和圖示分析，經(jīng)過4次PCR技術(shù)后獲得了新的基因，這是一種定點(diǎn)的基因突變技術(shù)。

②與研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），因此4次PCR應(yīng)該分別選擇如圖所示的引物如下表所示：

	引物A	引物B	引物C	引物D
PCR1	√	√	×	×
PCR2	×	×	√	√
PCR3	×	×	×	×
PCR4	√	×	×	√

（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照原則，若要比較新蛋白A的表達(dá)效率是否提高，則需設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)變量的處理分別為：僅含新蛋白質(zhì)A的重組質(zhì)粒，僅含蛋白A的重組質(zhì)粒和空白對(duì)照（僅含空質(zhì)粒，以排除空質(zhì)�？赡墚a(chǎn)生的影響）。因此，將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒）分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用抗原——抗體雜交方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A/span>基因表達(dá)效率是否提高。由于蛋白A（或新蛋白A）具有抗菌作用，所以為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較抑菌圈的大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，是因?yàn)榈鞍?/span>A基因的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全；不會(huì)造成基因污染；有效成分純度較高。