Question

4．金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應（PCR）擴增獲得目的基因，構建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理．PCR擴增過程示意圖如圖，請回答下列問題：

（1）從高表達MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于PCR擴增．
（2）設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物（引物1和引物2），為方便構建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點．設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對，而造成引物自連．
（3）圖中步驟1代表變性，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)．
（4）PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵．退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對．退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但GC含量高的引物需要設定更高的退火溫度．
（5）如果PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物，則可以采取的改進措施有②③（填序號：①升高退火溫度②降低退火溫度③重新設計引物）．

Answer 1

分析 PCR技術：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術．
2、原理：DNA復制．
3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物．
4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）．
5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈．PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開．

解答 解：（1）PCR擴增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴增．
（2）構建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點．設計的引物之間不能有堿基互補配對，否則引物自連，而不能與模板相連．
（3）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)．
（4）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對．由于G-C之間有三個氫鍵，A-T之間有兩個氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高．
（5）PCR反應得不到任何擴增產(chǎn)物，可能是退火溫度過高，導致引物與模板不能相連；或引物間相互配對，引物自連，不能與模板相連．因此，可通過降低退火溫度或重新設計引物進行改進．
故答案為：
（1）逆轉(zhuǎn)錄    cDNA
（2）限制性核酸內(nèi)切酶         堿基互補配對
（3）變性
（4）引物與模板     GC含量高
（5）②③

點評 本題主要考查基因工程的相關知識，要求學生理解PCR的具體過程，以及引物的作用，學會分析引物或溫度改變對PCR結果的影響．