Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動物領(lǐng)域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是__________的特定堿基排列順序。科研人員還在兩種引物的一端分別加上了__________和___________（填DNA序列），以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是_________。

A．Ti質(zhì)粒內(nèi)，限制酶的切割位點應(yīng)位于T-DNA內(nèi)

B．目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，每種限制酶只有一個切割位點

C．酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的元件還可以有____________，步驟③中需先用____________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過_________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是①________________________②_____________________________。

Answer 1

【答案】雞干擾素基因 GAATTC GGATCC AC 復(fù)制原點 鈣離子 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞 導(dǎo)入后未轉(zhuǎn)錄出mRNA

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增雞干擾素基因時，引物應(yīng)可以和雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列進(jìn)行堿基互補配對，因此，需要根據(jù)雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列來設(shè)計引物的堿基序列。據(jù)圖可知，該轉(zhuǎn)基因過程用EcoR I和BamH I兩種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，以避免質(zhì)�；蚰康幕�因的自身連接，應(yīng)在兩種引物的一端分別加上EcoR I和BamH I的識別序列GAATTC和GGATCC，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則為：

A、限制酶的切割位點應(yīng)位于Ti質(zhì)粒的T-DNA內(nèi)，這樣能保證目的基因插入到T-DNA中，而后目的基因可隨著T-DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的染色體DNA中，A正確；

B、目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中不能有種限制酶的切割位點，否則，達(dá)不到轉(zhuǎn)基因的目的，B錯誤；

C、酶切后，目的基因需要形成兩個不相同黏性末端，這樣能避免自身環(huán)化，C正確；

D、酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列也不能相同，否則會自身環(huán)化，D錯誤。

故選AC。

（2）基因表達(dá)載體中除含有啟動子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因和復(fù)制原點。據(jù)此可知，步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的元件還可以有復(fù)制原點，復(fù)制原點的存在，可以保證目的基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制，步驟③為導(dǎo)入受體細(xì)胞，這里的受體細(xì)胞是土壤農(nóng)桿菌，在將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌之前，可用鈣離子處理農(nóng)桿菌，以增大細(xì)胞壁通透性，提高轉(zhuǎn)化效率。

（3）步驟④為目的基因的檢測與鑒定，在該過程中，科研人員首先提取愈傷組織細(xì)胞的RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因為：①雞干擾素基因即便導(dǎo)入了農(nóng)桿菌，也不一定能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞；②導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因不一定能夠正常轉(zhuǎn)錄，也可能為轉(zhuǎn)錄出的雞干擾素的mRNA若被水解, 則不能通過逆轉(zhuǎn)錄獲得雞干擾素基因。