Question

【題目】我國一科研團(tuán)隊(duì)將小麥液泡膜Na+/K+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（TaNHX2基因）轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞內(nèi)，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽水稻新品種。圖1是獲取的含有目的基因的DNA片斷，Sau3AI、EcoRI、BamHI為三種限制酶，圖中箭頭所指為三種限制酶的切點(diǎn)；圖2是土壤農(nóng)桿菌中用于攜帶目的基因的Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。請分析回答：

（l）據(jù)圖分析可知，要構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要用________限制酶對DNA片段和質(zhì)粒進(jìn)行切割，再用____連接。

（2）為了獲得更多的目的基因用于實(shí)驗(yàn)研究，可以用小麥葉肉細(xì)胞的基因組為模板，利用TaNHX，基因的特異引物，通過________方法進(jìn)行擴(kuò)增，該方法用到的酶是____。

（3）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將耐鹽基因?qū)�入水稻�?xì)胞。先將耐鹽基因插入Ti質(zhì)粒的_________中，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，再通過農(nóng)桿菌侵染水稻細(xì)胞，將耐鹽基因插入水稻細(xì)胞的_________上，最后通過植物細(xì)胞工程中的____技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而使其遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。

（4）為了檢測實(shí)驗(yàn)成果，科研工作者在個(gè)體水平的檢測方法是____。

Answer 1

【答案】EcoRI DNA連接酶 PCR Taq酶（或耐高溫的DNA聚合酶） T-DNA 染色體DNA 植物組織培養(yǎng) 將轉(zhuǎn)基因水稻種植在鹽堿地上或用一定濃度的鹽水澆灌觀察結(jié)果

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）如圖所示，用EcoRI酶切可獲得目的基因，同時(shí)質(zhì)粒上也具有EcoRI酶切位點(diǎn)，因此可用EcoRI限制酶對DNA片段和質(zhì)粒進(jìn)行切割，再用DNA連接酶將兩個(gè)片段連接起來。

（2）在體外可用PCR擴(kuò)增技術(shù)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR用的酶是耐熱的Taq酶。

（3）在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻�?xì)胞（植物細(xì)胞）時(shí)，應(yīng)該將耐鹽基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入水稻細(xì)胞，并將其插入水稻細(xì)胞染色體的DNA上，最后通過植物細(xì)胞工程中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而使其遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。

（4）耐鹽目的基因在個(gè)體水平上的檢測方法是：將轉(zhuǎn)基因水稻種植在鹽堿地上或用一定濃度的鹽水澆灌觀察結(jié)果。