Question

【題目】苧麻纖維被普遍應(yīng)用于紡織和造紙行業(yè),但其中含有的膠質(zhì)必須被去除；與傳統(tǒng)的高溫堿煮相比，芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性果膠酶用于苧麻脫膠具有降低能耗和化學(xué)污染的優(yōu)勢(shì)，因此獲得高表達(dá)的堿性果膠酶基因工程菌，低成本生產(chǎn)堿性果膠酶對(duì)于紡織工業(yè)節(jié)能減排具有重要的意義。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）芽孢桿菌在產(chǎn)生堿性果膠酶的同時(shí)會(huì)分泌出對(duì)纖維有害的內(nèi)源性纖維素酶，因此將堿性果膠酶基因pel轉(zhuǎn)入畢赤酵母中表達(dá)，該過(guò)程需要_________________（工具酶）和載體，作為載體必須具備能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定保存，以及______________(至少答出兩點(diǎn))等條件。

（2）構(gòu)建的基因表達(dá)載體應(yīng)含有畢赤酵母的啟動(dòng)子作為_____________酶識(shí)別和結(jié)合的部位，從而啟動(dòng)目的基因的表達(dá)；同時(shí)還應(yīng)含有標(biāo)記基因，其作用是___________________。

（3）將基因表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母時(shí)，應(yīng)采用_______________________處理，使其處于________________________________。

（4）目的基因在受體細(xì)胞是否能翻譯出蛋白質(zhì)，可用______________技術(shù)來(lái)檢測(cè)。也可將導(dǎo)入目的基因的畢赤酵母接種于果膠底物平板上28℃培養(yǎng)， 2–3 d 后觀(guān)察結(jié)果如下圖（A為剛接種時(shí)，B為培養(yǎng)2–3d后），水解圈越大代表___________________________。

Answer 1

【答案】 限制酶和DNA連接酶 具有特定的限制酶切割位點(diǎn)、具有某些標(biāo)記基因 RNA聚合 將含有基因表達(dá)載體的畢赤酵母篩選出來(lái) 鈣離子（Ca2＋） 感受態(tài) 抗原-抗體雜交 對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)（或“對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶數(shù)量越多”）

【解析】本題以堿性果膠酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建為背景，綜合考查學(xué)生對(duì)DNA重組技術(shù)的基本工具、基因工程的基本操作程序等相關(guān)知識(shí)的識(shí)記和理解能力。

(1) 將堿性果膠酶基因pel（目的基因）轉(zhuǎn)入畢赤酵母（受體細(xì)胞）中表達(dá)，該過(guò)程需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，此時(shí)需要限制酶和DNA連接酶作為工具酶。作為載體必須具備的條件是：一是在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制，即能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因；二是具有特定的（或一個(gè)至多個(gè)）限制酶切點(diǎn)，以供外源DNA片段（目的基因）插入其中；三是具有某些標(biāo)記基因，以便供重組DNA的鑒定和選擇。

(2)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，標(biāo)記基因的作用是將含有基因表達(dá)載體的畢赤酵母（受體細(xì)胞）篩選出來(lái)。

(3) 畢赤酵母屬于單細(xì)胞的微生物；將基因表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母時(shí)，應(yīng)采用鈣離子（Ca2＋）處理畢赤酵母，使其處于感受態(tài)。

(4) 目的基因在受體細(xì)胞是否能翻譯出蛋白質(zhì)，可用抗原-抗體雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)。導(dǎo)入目的基因的畢赤酵母產(chǎn)生的堿性果膠酶能水解平板上的果膠，形成水解圈；水解圈越大，代表對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)（或“對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶數(shù)量越多”）。