Question

6．基因打靶技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上而發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)．結(jié)合圖示回答問(wèn)題．

注：neo^r是新霉素抗性基因；tk基因的表達(dá)可以使無(wú)毒的丙氧鳥(niǎo)苷代謝為毒性物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡．
（1）將目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的DNA 片段都重組到載體（或質(zhì)粒）上，構(gòu)建打靶載體（基因表達(dá)載體）．
（2）打靶載體測(cè)序驗(yàn)證正確后，利用限制酶，將之線(xiàn)性化，以提高重組率．通過(guò)顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，這樣打靶載體與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有幾率發(fā)生同源重組．
（3）為了篩選發(fā)生同源重組的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中加入新霉素和丙氧鳥(niǎo)苷．最后還需要通過(guò)DNA分子雜交技術(shù)鑒定同源重組的細(xì)胞（去除靶基因），將這樣的細(xì)胞通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞（或克�。┡囵B(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細(xì)胞．其中，暫時(shí)不用的細(xì)胞進(jìn)行液氮（或冷凍）保存．
（4）將打靶成功的細(xì)胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）的母鼠體內(nèi)，一段時(shí)間后對(duì)受體母鼠進(jìn)行妊娠檢查，確保其生下嵌合小鼠．這種嵌合體小鼠長(zhǎng)大后，體內(nèi)同時(shí)存在被“修飾”過(guò)的基因和未被“修飾”的基因．如果某些小鼠的生殖細(xì)胞（選填“體細(xì)胞”、“生殖細(xì)胞”）恰巧被“修飾”過(guò)了，則它們的雜交后代中，就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過(guò)的小鼠．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）分析題圖可知，將目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的DNA 片段都重組到載體（或質(zhì)粒）上，構(gòu)建打靶載體（基因表達(dá)載體）．
（2）打靶載體測(cè)序驗(yàn)證正確后，利用限制酶，將之線(xiàn)性化，以提高重組率．通過(guò)顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，這樣打靶載體與細(xì)胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有幾率發(fā)生同源重組．
（3）neo^r是新霉素抗性基因，tk基因的表達(dá)可以使無(wú)毒的丙氧鳥(niǎo)苷代謝為毒性物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此為了篩選發(fā)生同源重組的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中加入新霉素和丙氧鳥(niǎo)苷．最后還需要通過(guò)DNA分子雜交技術(shù)鑒定同源重組的細(xì)胞（去除靶基因），將這樣的細(xì)胞通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞（或克�。┡囵B(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細(xì)胞．其中，暫時(shí)不用的細(xì)胞進(jìn)行液氮（或冷凍）保存．
（4）將打靶成功的細(xì)胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）的母鼠體內(nèi)，一段時(shí)間后對(duì)受體母鼠進(jìn)行妊娠檢查，確保其生下嵌合小鼠．這種嵌合體小鼠長(zhǎng)大后，體內(nèi)同時(shí)存在被“修飾”過(guò)的基因和未被“修飾”的基因．如果某些小鼠的生殖細(xì)胞恰巧被“修飾”過(guò)了，則它們的雜交后代中，就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過(guò)的小鼠．
故答案為：
（1）載體（或質(zhì)粒）
（2）限制       顯微注射
（3）新霉素和丙氧鳥(niǎo)苷      DNA分子雜交       動(dòng)物細(xì)胞（或克�。�
（4）生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）     妊娠       生殖細(xì)胞

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程的原理及技術(shù)以及胚胎工程的有關(guān)知識(shí)，重點(diǎn)考查基因工程的操作步驟，要求考生識(shí)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程，識(shí)記胚胎工程的操作過(guò)程，屬于考綱識(shí)記層次的考查．