Question

【生物技術(shù)實(shí)踐】
2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予在“基因靶向”技術(shù)方面作出突出貢獻(xiàn)的三位科學(xué)家．“基因靶向”技術(shù)，指的是應(yīng)用DNA同源重組原理，通過一定的載體，用設(shè)計(jì)好的目的基因替代靶基因，從而達(dá)到使靶基因功能喪失的目的．借助這一技術(shù)，科學(xué)家可以用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使其體內(nèi)的某項(xiàng)特定基因喪失功能，以幫助人們找到治療疾病的有效方法．下面是該實(shí)驗(yàn)的基本過程，請(qǐng)回答有關(guān)問題．
（1）獲得胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）．實(shí)驗(yàn)一般采用ES細(xì)胞作為目的基因的受體細(xì)胞，這是因?yàn)镋S細(xì)胞具有發(fā)育的

 

．舉出一例獲取ES細(xì)胞的常用方法：

 

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（2）獲取目的基因．
①目的基因是靶基因的同源片段．經(jīng)過修飾使靶基因的功能改變或喪失，就可獲得目的基因．如果要獲得活性降低了的X酶蛋白的目的基因，可以采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，請(qǐng)簡(jiǎn)述其過程．

 

②為了提高實(shí)驗(yàn)成功率，需要通過PCR技術(shù)獲得目的基因的大量拷貝．與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR反應(yīng)體系需加入哪兩種特別的物質(zhì)？

 

（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體．質(zhì)粒是具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA，它所具有的一至多個(gè)

 

位點(diǎn)，使目的基因插入其中成為可能，因此常被選作運(yùn)載體．
（4）將基因表達(dá)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，從中篩選出成功發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞，然后培育出小鼠．
①由ES細(xì)胞培育出小鼠的過程中，需要采用哪些技術(shù)手段？

 

②通過檢測(cè)目的基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)品，可以確定該小鼠體內(nèi)是否成功發(fā)生了基因的同源重組．請(qǐng)簡(jiǎn)述這種檢測(cè)方法．

 

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Answer 1

考點(diǎn)：胚胎干細(xì)胞的來源及分化,胚胎移植

專題：

分析：1、胚胎干細(xì)胞簡(jiǎn)稱ES或EK細(xì)胞，來源于早期胚胎或原始性腺；在功能上，具有發(fā)育的全能性，可分化為成年動(dòng)物任何一種組織細(xì)胞．
2、根據(jù)中心法則逆推以確定目的基因的堿基序列：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有氨基酸序列→找到對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）．
3、作為運(yùn)載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點(diǎn)；②要有標(biāo)記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無害，而且要易從供體細(xì)胞分離出來．
4、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 常用抗原-抗體雜交技術(shù)．

解答： 解：（1）ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，則一般采用ES細(xì)胞作為目的基因的受體細(xì)胞；獲取ES細(xì)胞的常用方法：從早期胚胎（囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）中分離；從胎兒的原始性腺中分離：通過核移植技術(shù)培育得到．
（2）①采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得活性降低了的X酶蛋白的目的基因過程：x酶蛋白的功能分析；x酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)；x酶多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)；x酶基因的改造．
②PCR技術(shù)的原理是DNA分子復(fù)制，與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR反應(yīng)體系需加入兩種引物、耐熱的DNA聚合酶．
（3）質(zhì)粒是具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA，具有一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，使目的基因插入其中成為可能，因此常被選作運(yùn)載體．
（4）將基因表達(dá)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，從中篩選出成功發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞，然后培育出小鼠．
①由ES細(xì)胞培育出小鼠的過程中，需要采用早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)和胚胎移植技術(shù)．
②通過檢測(cè)目的基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)品，檢測(cè)方法：提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交．
故答案為：
（1）全能性
從早期胚胎（囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）中分離；從胎兒的原始性腺中分離：通過核移植技術(shù)培育得到
（2）①x酶蛋白的功能分析；x酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)；x酶多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)；x酶基因的改造．
②兩種引物、耐熱的DNA聚合酶
（3）限制酶切割
（4）①早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)和胚胎移植技術(shù)
②提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交．

點(diǎn)評(píng)：本題考查胚胎干細(xì)胞、蛋白質(zhì)工程、基因工程等相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生分析問題和解決問題的能力，難度不大．