Question

6．如表是幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的而不重復(fù)標(biāo)注．請回答下列問題．

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識別序列及切割位點(diǎn)

（1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ，酶切后的載體和目的基因片段通過DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒．
（2）若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同，這兩種酶都不能（選填“都能”“都不能”或“只有一種能”）切開連接的部位，原因是核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ識別切割．
（3）若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（4）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．

Answer 1

分析 解答本題的關(guān)鍵在于理解重組質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用．選擇限制酶需注意插入目的基因時(shí)不能破壞標(biāo)記基因．PCR擴(kuò)增基因時(shí)，兩種引物結(jié)合的部位相反，延伸的方向相反．限制酶具有特異性，不同的限制酶識別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割片斷，應(yīng)該據(jù)該片段中是否含有限制酶的識別序列．
根據(jù)題意和圖示分析可知：在質(zhì)粒上存在BamH I、BclⅠ、BamH I和HindⅢ等四個(gè)酶切位點(diǎn)，其中BamH I的切割位點(diǎn)在兩個(gè)抗性基因上都有，而抗性基因?yàn)檩d體的標(biāo)記基因，因此不可用該酶切割．在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點(diǎn)．

解答 解：（1）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，且會(huì)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)抗性基因；Sau3A I在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，也會(huì)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)抗性基因，不利于后期的篩選，所以應(yīng)選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ．選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩側(cè)切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接．
（2）BamHⅠ酶切得DNA末端與BclⅠ酶切得DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同（即同尾酶），但是被DNA連接酶連接后便不能再被這兩種限制酶切割了，因?yàn)椴粷M足兩種限制酶對識別序列的特異性要求．
（3）根據(jù)BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位點(diǎn)，Sau3A I在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（4）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素（根據(jù)標(biāo)記基因的種類），平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物應(yīng)具有成對反向的特點(diǎn)．
故答案為：
（1）BclⅠ和HindⅢDNA連接
（2）黏性末端相同    都不能    核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ識別切割
（3）7
（4）四環(huán)素    引物甲和引物丙

點(diǎn)評 本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識準(zhǔn)確答題，屬于考綱應(yīng)用和理解層次的考查．