Question

5．為研究水稻D基因的功能，研究者將T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d．現(xiàn)以野生植株和突變植株作為親本進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計母本植株的結(jié)實(shí)率，結(jié)果如下表所示．

雜交編號	親本組合	結(jié)實(shí)數(shù)/授粉的小花數(shù)	結(jié)實(shí)率
①	♀DD×♂dd	16/158	10%
②	♀dd×♂DD	77/154	50%
③	♀DD×♂DD	71/141	50%

（1）表中數(shù)據(jù)表明，D基因失活使雄配子育性降低．為確定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可將D基因作為目的基因，與載體連接后，導(dǎo)入到突變（填“野生”或“突變”）植株的幼芽經(jīng)過脫分化（或“去分化”）形成的愈傷組織中，最后觀察轉(zhuǎn)基因水稻配子育性是否得到恢復(fù)．
（2）用顯微鏡觀察并比較野生植株和突變植株的配子形成，發(fā)現(xiàn)D基因失活不影響二者的減數(shù)分裂．
（3）進(jìn)一步研究表明，配子育性降低是因?yàn)镈基因失活直接導(dǎo)致配子本身受精能力下降．若讓雜交①的F₁給雜交②的F₁授粉，預(yù)期結(jié)實(shí)率為30%，所獲得的F₂植株的基因型及比例為DD：Dd：dd=5：6：1．
（4）為驗(yàn)證F₂植株基因型及比例，研究者根據(jù)D基因、T-DNA的序列，設(shè)計了3種引物，如圖所示：
隨機(jī)選取F₂植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進(jìn)行PCR，檢測是否擴(kuò)增（完整的T-DNA過大，不能完成PCR）．若兩種引物組合均可完成擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為Dd；同理可判斷其他基因型，進(jìn)而統(tǒng)計各基因型比例．
（5）研究表明D基因表達(dá)產(chǎn)物（D蛋白）含有WD40（氨基酸序列），而通常含有WD40的蛋白都定位在細(xì)胞核內(nèi)．為探究D蛋白是否為核蛋白，研究者將D基因與黃色熒光蛋白基因融合；同時將已知的核蛋白基因與藍(lán)色熒光蛋白基因融合．再將兩種融合基因?qū)�入植物原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)，如果兩種熒光的定位（模式）相同（或“兩種熒光同時出現(xiàn)在細(xì)胞核中”），則表明D蛋白是核蛋白．

Answer 1

分析 分析表格：②③組都是DD做父本，結(jié)實(shí)率都為50%，①組是dd做父本，結(jié)實(shí)率為10%．所以可以猜測D基因失活后會使雄配子的育性降低．且DD做父本，結(jié)實(shí)率都為50%，可以得出D的雄配子中可育的占$\frac{1}{2}$；dd做父本，結(jié)實(shí)率為10%，可以得出d的雄配子中可育的占$\frac{1}{10}$．

解答 解：（1）②③兩組中雄性個體的基因型均為DD，不論雌性個體的基因型是什么，后代結(jié)實(shí)率均為50%，說明D基因失活與雌配子的育性無關(guān)；又已知①中雄性個體的基因型為dd（D基因失活），后代結(jié)實(shí)率只有10%，說明D基因失活使雄配子育性降低．愈傷組織是外植體脫分化形成的．為確定配子育性降低是由于D基因失活造成的，可將D基因作為目的基因，與載體連接后，導(dǎo)入到突變植株的愈傷組織中，最后觀察轉(zhuǎn)基因水稻配子育性是否得到恢復(fù)．
（2）配子是減數(shù)分裂形成的，而減數(shù)分裂過程可用顯微鏡進(jìn)行觀察．
（3）在第（1）小問中：DD做父本，結(jié)實(shí)率都為50%，可以得出D的雄配子中可育的占$\frac{1}{2}$；dd做父本，結(jié)實(shí)率為10%，可以得出d的雄配子中可育的占$\frac{1}{10}$．若讓雜交①的F₁（Dd）給雜交②的F₁（Dd）授粉，則結(jié)實(shí)率為（10%+50%）÷2=30%．若讓雜交①的F₁（Dd）給雜交②的F₁（Dd）授粉，兩者基因型都為Dd，產(chǎn)生的配子都為D：d=1：1．但是雄配子的可育性D是d的5倍，所以可育的雄配子D：d=5：1，可育的雌配子D：d=1：1．那么就會有如下的雜交結(jié)果：

（4）
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ引物的結(jié)合位點(diǎn)如上圖所示，根據(jù)題中信息“完整的T-DNA過大，不能完成PCR”，且d基因的產(chǎn)生是T-DNA插入了D基因內(nèi)部，所以如果以D基因?yàn)槟０�，Ⅱ、Ⅲ引物組合可以擴(kuò)增出一種片段，以突變后的D基因（d基因）為模板，Ⅰ、Ⅲ引物組合可以擴(kuò)增出另外一種片段．如果某植株的基因型是Dd，則從其體內(nèi)提取出來的作為擴(kuò)增的模板就有兩種，兩種引物組合都能夠進(jìn)行擴(kuò)增．
（5）從題中信息可以看到有一個對照實(shí)驗(yàn)：對照組：已知的核蛋白基因+藍(lán)色熒光蛋白基因→植物原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)；實(shí)驗(yàn)組：D蛋白基因+黃色熒光蛋白基因→植物原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)．所以，如果兩種顏色的熒光都出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)，就表明D蛋白是核蛋白．
故答案為：
（1）雄    D基因    突變     脫分化（或“去分化”）
（2）顯微鏡    減數(shù)
（3）30%    DD：Dd：dd=5：6：1
（4）兩種引物組合均可完成擴(kuò)增
（5）兩種熒光的定位（模式）相同（或“兩種熒光同時出現(xiàn)在細(xì)胞核中”）

點(diǎn)評 本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟需要注意的細(xì)節(jié)，能結(jié)合表中和圖中信息準(zhǔn)確答題，難度較大，需要考生有牢固的基礎(chǔ)知識和較高的圖文分析能力．