Question

【題目】VNN1基因（1542bp）與炎癥相關(guān)性疾病有關(guān)，GFP基因（4735bp）控制綠色熒光蛋白的合成，該蛋白可在相應(yīng)波長(zhǎng)的紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。某研究小組進(jìn)行鼠源GFP - VNNI重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能研究，回答下列問(wèn)題：

（l）為構(gòu)建重組質(zhì)粒，研究小組從數(shù)據(jù)庫(kù)查找到VNNl的DNA序列，并設(shè)計(jì)引物。上游引物：5-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)），下游引物：5-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)），之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的原理是________。擴(kuò)增后的VNNI基因要與含GFP基因的載體連接，需用________（填具體酶）切割VNNI基因和含GFP基因的載體，再用________酶處理，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

（2）GFP基因在重組質(zhì)粒中可作為________________，其作用是________。用之前相同的限制酶對(duì)GFP - VNNI重組質(zhì)粒切割后，進(jìn)行電泳鑒定時(shí)得到如圖1所示的部分條帶，結(jié)果表明________。

（3）IL -6為體內(nèi)重要的炎癥因子，能與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活炎癥反應(yīng)。圖2為GFP-VNNI重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞分泌IL -6的影響，由此說(shuō)明________________，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與正常組比較，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組IL-6的表達(dá)有輕微升高，造成這種現(xiàn)象的可能原因是________________________。

Answer 1

【答案】DNA雙鏈復(fù)制 HindⅢ酶和BamHⅠ酶 DNA連接 標(biāo)記基因 鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái) VNN1基因已插入到含GFP基因的載體中（合理即可） VNN1基因表達(dá)產(chǎn)物能促進(jìn)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6 操作過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損傷（或用到的化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用），可以激活相應(yīng)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6

【解析】

基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的獲取：原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建

第三步：將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞

常用的轉(zhuǎn)化方法：

將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和 花粉管通道法等。

將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是 顯微注射技術(shù)；

將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：先用 Ca2+處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過(guò)程。

第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)。

（1）PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制，為防止切割的質(zhì)粒環(huán)化，通常選擇兩種的限制酶進(jìn)行切割，同時(shí)需要用相同的限制酶對(duì)目的基因進(jìn)行處理，所以選擇HindⅢ酶和BamHI切割VNNI基因和含GFP基因的載體，再用DNA連接酶處理形成重組質(zhì)粒。

（2）GFP基因（4735bp）控制綠色熒光蛋白的合成，該蛋白可在相應(yīng)波長(zhǎng)的紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，所以在重組質(zhì)粒中可以作為標(biāo)記基因；鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)；電泳條帶顯示分子量增加表明VNN1基因已插入到含GFP基因的載體中。

（3）從柱狀圖中看出VNN1組中IL-6的濃度增加，說(shuō)明了VNN1基因表達(dá)產(chǎn)物能促進(jìn)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組IL-6的表達(dá)有輕微升高，可能原因是操作過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損傷（或用到的化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用），可以激活相應(yīng)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6。