Question

12．多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細(xì)胞壁破損．成熟的番茄果實(shí)中，PG合成顯著增加，能使果實(shí)變紅變軟，但不利于保鮮． 利用第基因工程減少PG基因的表達(dá)，可延長(zhǎng)果實(shí)保質(zhì)期．科學(xué)家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入番茄細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄，具體操作流程如圖．據(jù)圖回答下列問(wèn)題：

（1）若已獲取PG的mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲取PG基因．
（2）改造過(guò)程需要用到的工具有限制酶、DNA連接酶和質(zhì)粒，若得到的目的基因兩側(cè)需人工合成BamHⅠ黏性末端，己知BamHⅠ的識(shí)別序列如下圖甲所示，請(qǐng)?jiān)诖痤}紙上圖乙相應(yīng)位置畫出目的基因兩側(cè)的黏性末端．

（3）在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確�；�因的反義轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有RNA聚合酶酶結(jié)合位點(diǎn)，在該番茄新品種的培育過(guò)程中，將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的方法叫做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法．
（4）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．之后還需將其置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細(xì)胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（5）將轉(zhuǎn)入反向鏈接PG基因的番茄細(xì)胞培育成完整的植株，需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)操作過(guò)程中除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加植物激素．
（6）若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長(zhǎng)（填“長(zhǎng)”或“短”），則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）以RNA為模板合成DNA的過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄，所以若已獲取PG的mRNA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄法獲取PG基因．
（2）基因工程中改造過(guò)程需要用到的工具有限制酶、DNA連接酶和質(zhì)粒，若得到的目的基因兩側(cè)需人工合成BamHⅠ黏性末端，根據(jù)BamHⅠ的識(shí)別序列，可知目的基因兩側(cè)的黏性末端為：

（3）基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA，在轉(zhuǎn)錄時(shí)需要RNA聚合酶．在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確保基因的反義轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，在該番茄新品種的培育過(guò)程中，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞．
（4）由圖可知，重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞，因此用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．之后還需將其置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細(xì)胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來(lái)鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（5）將轉(zhuǎn)入反向鏈接PG基因的番茄細(xì)胞培育成完整的植株，需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)操作過(guò)程中除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加植物激素即生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素．
（6）若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長(zhǎng)，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．
故答案為：
（1）逆轉(zhuǎn)錄（或cDNA文庫(kù)）
（2）限制酶、DNA連接酶和質(zhì)粒
   
（3）RNA聚合      農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
（4）卡那霉素        是否發(fā)生質(zhì)壁分離
（5）植物組織培養(yǎng)    植物激素      
（6）長(zhǎng)

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識(shí)，要求考生掌基因工程的原理和具體操作步驟，認(rèn)真分析轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，理解轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期時(shí)間長(zhǎng)的原因；識(shí)記植物組織培養(yǎng)的過(guò)程及應(yīng)用，能結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題．