Question

2．多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果膠使細胞壁破損．成熟的番茄果實中，PG合成顯著增加，能使果實變紅變軟，但不利于保鮮．利用基因工程減少PG基因的表達，可延長果實保質(zhì)期．科學家將PG基因反向接到Ti質(zhì)粒上，導入番茄細胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄，具體操作流程如圖．據(jù)圖回答下列問題：

（1）若已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄法獲取PG基因．已知BamHI的識別序列如圖2甲所示，請在圖2乙相應位置畫出目的基因兩側(cè)的黏性末端．
（2）用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選，理由是重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞．之后，還需將其置于質(zhì)量分數(shù)為0.3g/ml的蔗糖溶液中，觀察細胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來鑒別細胞壁是否再生．
（3）由于導入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達．若番茄果實的保質(zhì)期延長，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功．
（4）將轉(zhuǎn)入反向鏈接PG基因的番茄細胞培育成完整的植株，需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù)；其中，愈傷組織經(jīng)再分化（或細胞增殖和分化）形成完整植株，此過程除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加植物激素（生長調(diào)節(jié)劑、生長素和細胞分裂素）．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）若已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄法獲取PG基因．根據(jù)BamHⅠ的識別序列，可知目的基因兩側(cè)的黏性末端為：．
（2）由圖可知，重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞，因此用含目的基因的農(nóng)桿菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選．之后，還需將其置于質(zhì)量分數(shù)為0.3g/ml的蔗糖溶液中，觀察細胞細胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象來鑒別細胞壁是否再生．
（3）由于導入的目的基因能轉(zhuǎn)錄出反義RNA，且能與天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補結(jié)合，因此可抑制PG基因的正常表達．若番茄果實的保質(zhì)期延長，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄培育成功．
（4）將轉(zhuǎn)基因番茄細胞培育成完整植株需采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，其過程為轉(zhuǎn)基因番茄細胞$\stackrel{脫分化}{→}$愈傷組織$\stackrel{再分化}{→}$胚狀體→轉(zhuǎn)基因番茄，該技術(shù)操作過程中除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加植物激素即生長素和細胞分裂素．
故答案為：
（1）逆轉(zhuǎn)錄法    
（2）卡那霉素      重組質(zhì)粒中含卡那霉素抗性基因而四環(huán)素抗性基因被破壞       是否發(fā)生質(zhì)壁分離
（3）天然的PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA      番茄果實的保質(zhì)期延長
（4）植物組織培養(yǎng)      再分化（或細胞增殖和分化）     植物激素（生長調(diào)節(jié)劑、生長素和細胞分裂素）

點評 本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識，要求考生掌基因工程的原理和具體操作步驟，認真分析轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，理解轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期時間長的原因；識記植物組織培養(yǎng)的過程及應用，能結(jié)合圖中信息準確答題．