Question

【題目】下圖是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答下列問題：

（1）EcoRⅤ酶切位點為，EcoRⅤ酶切出來的線性載體P1為_______末端。

（2）用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增獲得目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸，載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為_______的脫氧核苷酸，形成P2，P2和目的基因片段在_______酶作用下，形成重組質粒P3。PCR技術中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內的DNA聚合酶，其最主要的特點是_____________________________________。

（3）PCR技術可以臨床用于診斷感染性疾病、腫瘤及遺傳病等，它是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，其標準步驟為_______、退火、__________。

（4）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了___________________。若該目的基因是從cDNA文庫中分離獲取的蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體中，然后在_______為唯一含碳營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達的初步檢測。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA 連接酶 耐高溫 變性 延伸 鑒別和篩選含目的基因的細胞 蔗糖

【解析】

1、基因表達載體的基本結構包括復制原點、目的基因、標記基因、啟動子、終止子等。其中標記基因的作用是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來，常用的標記基因是抗生素抗性基因。根據題干信息和圖形分析，P0是載體質粒，其含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）都屬于標記基因，可以用檢測目的基因是否導入受體細胞；EcoRV酶為限制酶，其切割質粒后悔破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr）。

2、PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

（1）根據題意分析，EcoRV酶識別的序列是-GATATC-，并且兩條鏈都在識別序列的堿基的中軸線T與A之間進行切割，因此其切出來的線性載體P1為平末端。

（2）據圖分析，目的基因兩側為粘性末端，且漏出的堿基為A，則在載體P1的兩端需要個加一個胸腺嘧啶堿基T形成具有粘性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來形成重組質粒P3。由于在PCR擴增技術中采用高溫使其變形解旋，因此需要使用的DNA聚合酶具有耐高溫的特點。

（3）根據以上分析可知，PCR技術的標準步驟包括變性、退火、延伸。

（4）根據以上分析可知，重組質粒中抗生素抗性基因屬于標記基因，其作用是鑒別和篩選含目的基因的細胞。根據題意可知，該目的基因是從cDNA文庫中分離獲取的蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體中，在個體水平上鑒定目的基因是否表達，可以在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，如果大腸桿菌細胞內目的基因表達出了蔗糖轉運蛋白，該大腸桿菌能夠進行正常的生長和繁殖，則說明目的基因完成了表達過程。