Question

【題目】華蟾素注射液是將蟾蜍的全皮陰干后，提煉而成的中藥復(fù)方制劑，是我國(guó)經(jīng)典抗腫瘤藥物。 研究人員為探尋華蟾素注射液抗肝癌 HepG-2 細(xì)胞的作用機(jī)理，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)根據(jù)題中信息回答下列問(wèn)題。

Ⅰ.肝癌 HepG-2 細(xì)胞的培養(yǎng)：

（1）培養(yǎng)肝癌HepG-2細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)基中加入適量的__________以補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)，為防止培養(yǎng)過(guò)程發(fā)生污染要加入____________。此外，每 48h 更換 1 次培養(yǎng)液，目的是________________。

Ⅱ.探究華蟾素藥效作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)：

（2）用不同濃度的華蟾素注射液分別處理 HepG-2 細(xì)胞 12h、24h 和 48h，測(cè)定華蟾素注射液對(duì) HepG-2 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如下圖。

由圖甲可知，華蟾素能有效地______肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，且與______呈正相關(guān)。圖乙的結(jié)果進(jìn)一步表明，華蟾素對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響體現(xiàn)在______________。

（3）DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（簡(jiǎn)稱 TopoⅡ）為真核生物所必需，在 DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及形成正確的染 色體結(jié)構(gòu)、染色體分離、濃縮等方面發(fā)揮重要作用，TopoⅡ在腫瘤細(xì)胞中含量明顯高于正常細(xì)胞。 華蟾素注射液處理 HepG-2 細(xì)胞 48h 后，采用 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè) TopoⅡ基因的表達(dá)情況，RT﹣PCR是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合的技術(shù)，具體過(guò)程如圖丙。

①RT-PCR 即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。其主要原理是：提取HepG-2 細(xì)胞中的總 RNA， 以一段_______作為引物，在________酶的作用下合成 cDNA，再以 cDNA 為模板進(jìn)行_________。

②要對(duì)圖中單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上至少需要___________個(gè)引物B。

Answer 1

【答案】血清（血漿） 抗生素 防止代謝物質(zhì)的積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害 抑制 作用時(shí)間和濃度 將癌細(xì)胞阻滯在S期 與TopoⅡMrna互補(bǔ)的單鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 2n-1

【解析】

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：（1）無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境：①消毒、滅菌；②添加一定量的抗生素；③定期更換培養(yǎng)液，以清除代謝廢物。（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等，還需加入血清、血漿等天然物質(zhì)。（3）溫度和PH：36.5℃±0.5℃；適宜的pH：7.2～7.4。（4）氣體環(huán)境：95%空氣（細(xì)胞代謝必需的）和5%的CO2（維持培養(yǎng)液的PH）。

2、逆轉(zhuǎn)錄是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，以RNA為模板合成DNA的過(guò)程。

3、PCR技術(shù)可在體外大量擴(kuò)增目的基因。

Ⅰ．（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了補(bǔ)充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)，應(yīng)該在培養(yǎng)基中加入適量的血清（血漿）；為防止培養(yǎng)過(guò)程發(fā)生污染要加入抗生素；此外，每48h更換1次培養(yǎng)液，目的是防止代謝物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害（補(bǔ)充細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）。

Ⅱ．（2）根據(jù)圖1可知，華蟾素能有效地抑制肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，且與作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)；圖乙的結(jié)果進(jìn)一步表明，使用華蟾素后，S期細(xì)胞比例增多，因此對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響體現(xiàn)在將癌細(xì)胞阻滯在S期。

（3）①RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，其主要原理是：提取HepG-2細(xì)胞中的總RNA，以一段與TopoⅡmRNA互補(bǔ)的單鏈DNA作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

②由圖丙可知，要對(duì)圖中單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，結(jié)果共形成2n個(gè)DNA，每個(gè)DNA兩條鏈，因此理論上至少需要的引物B數(shù)量=（2n×2-2）×2=2n -1（個(gè)）。