Question

【題目】已知限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、BclⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT。圖1，圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）基因工程常用載體除質(zhì)粒外，還有___________________。若要使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，原因是__________（答兩點(diǎn)）

（2）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，若只能選擇一種限制酶，則應(yīng)選用__________來(lái)切割。為避免目的基因反向插入帶來(lái)的不正常表達(dá)，應(yīng)選用兩種限制酶__________切割質(zhì)粒，選用兩種限制酶___________________切割含目的基因的DNA片段。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，可以從圖2的A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取__________作為引物。

Answer 1

【答案】動(dòng)植物病毒，λ噬菌體衍生物 目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)，目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子 HindⅢ
HindⅢ和BamHⅠ HindⅢ和Sau3AⅠ B和C

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）基因工程常用載體有質(zhì)粒、動(dòng)植物病毒、λ噬菌體衍生物。若要使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，原因是目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)，也無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子。
（2）根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶分布可知，若只能選擇一種限制酶來(lái)切割目的基因和質(zhì)粒，則應(yīng)選用HindⅢ來(lái)切割。為避免目的基因反向插入帶來(lái)的不正常表達(dá)，應(yīng)該選用兩種酶切割目的基因和質(zhì)粒，由于限制酶Sau3AⅠ也能切割限制酶BclⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列，因此用該酶切割質(zhì)粒時(shí)會(huì)破壞兩種標(biāo)記基因，則應(yīng)選用兩種限制酶HindⅢ和BamHⅠ切割質(zhì)粒，選用兩種限制酶HindⅢ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。
（3）由于DNA聚合酶只能從5'到3'延伸子鏈，因此利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，可以從中選取B和C作為引物。