Question

【題目】正常細胞不能合成干擾素，但含有干擾素基因。我國科學家釆用基因工程技術生產干擾素a-2b已實現量產。具體做法是將產生干擾素的人白細胞的mRNA分離，反轉錄得到干擾素基因。將含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質粒PBR322和干擾素基因進行雙酶切，用連接酶連接。將重組載體DNA分子在一定條件下導入大腸桿菌，在培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，檢測干擾素的表達量，選出高效表達的工程菌。請回答：

（1）在分化誘導因子作用下，正常細胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發(fā)生的實質是________________________________

（2）據下圖分析，構建重組載體DNA分子時，可以選用_____兩種限制酶對質粒pBR322和干擾素基因進行雙酶切，目的是既能保證目的基因和質粒正向連接，又能防止_____________________________(答兩點)。

（3）將重組質粒導入大腸桿菌中，然后將細菌涂布到含_____的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到含質粒PBR322或重組質粒的細菌單菌落；再從每一個單菌落中挑取部分細菌轉涂到含有_____的培養(yǎng)基上，不能生長的絕大部分是含有重組質粒的細菌，原因是_____

（4）干擾素在體外保存非常困難，如果將其分子中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，在-70°C 條件下可以保存半年。實現這一轉變需要直接對_____進行修飾或改造，這屬于蛋白質工程的范疇。

Answer 1

【答案】基因的選擇性表達 酶B、酶C 質粒與目的基因自身環(huán)化；防止同時破壞質粒中的兩個標記基因 氨芐青霉素 四環(huán)素 目的基因的插入破壞了四環(huán)素抗性基因，重組質粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質粒上含氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，導入重組質粒的細菌不能生長，而只導入質粒的細菌能生長 基因

【解析】

1、基因表達載體的組成：目的基因、啟動子、終止子、標記基因等。標記基因可便于目的基因的鑒定和篩選。

2、由于不同限制酶識別的堿基序列不同，所以在切割質粒和目的基因時常用雙酶切，可防止目的基因反向粘連和質粒自行環(huán)化。

（1）細胞分化的實質是基因選擇性表達，故在分化誘導因子作用下，正常細胞可以擺脫抑制、合成干擾素，該過程發(fā)生的實質是基因的選擇性表達。

（2）標記基因可用于鑒定目的基因是否導入受體細胞，所以重組質粒上至少要保留一個標記基因，由于兩個標記基因上均含有酶A的切點，所以不能用酶A切割，為了防止連接時目的基因和質粒自身環(huán)化，故在構建重組載體DNA分子時，可以選用酶B和酶C兩種限制酶對質粒pBR322和干擾素基因進行雙酶切。

（3）由于質粒和重組質粒上都含有氨芐青霉素抗性基因，而未導入質粒的細菌不含有該抗性基因，所以將重組質粒導入大腸桿菌中，然后將細菌涂布到含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到含質粒PBR322或重組質粒的細菌單菌落；由于目的基因的插入破壞了四環(huán)素抗性基因，重組質粒上只含有氨芐青霉素抗性基因，而質粒上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，因此再從前面培養(yǎng)基上獲得的每一個單菌落中挑取部分細菌轉涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，不能生長的絕大部分是含有重組質粒的細菌。

（4）蛋白質工程是通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造的一項技術。