Question

【題目】下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請分析回答下列問題。

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達【5’AOX1和3’AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子】。

資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了如圖所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達。

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上________________、 ____________限制酶識別序列， 這樣設(shè)計的優(yōu)點是避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用____________將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取____________。

（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶____________來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選，轉(zhuǎn)化后的細胞中HBsAg基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，可以用____________方法進行檢測。

（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入____________以維持其生活，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達。

（6）與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質(zhì)合成后，細胞可以對其進行____________并分泌到細胞外，便于提取。

Answer 1

【答案】(8分)

(1)SnaBⅠ AvrⅡ (2)DNA連接酶 大量重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒不得分） (3)BglⅡ

(4)DNA分子雜交 (5)甲醇 (6)加工(修飾)

【解析】(1)重組質(zhì)粒上的目的基因若要表達，目的基因的首端和尾端需含有啟動子和終止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側(cè)的A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種限制酶對質(zhì)粒和目的基因同時進行切割，便會各自出現(xiàn)相同的黏性末端，便于重組與表達，同時可防止自身環(huán)化，因此在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置應(yīng)接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列。

(2)用DNA連接酶可將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)的目的是：利用大腸桿菌的無性繁殖，短時間內(nèi)獲取大量的重組質(zhì)粒。

(3)重組DNA的兩側(cè)分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其他限制酶均會破壞含有啟動子、終止子的目的基因。所以步驟3中應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細胞。

(4)可用DNA分子雜交技術(shù)檢測巴斯德畢赤酵母菌內(nèi)是否導(dǎo)入了目的基因。

(5)資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時可誘導(dǎo)HBsAg基因表達，據(jù)此可知：轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達。

(6) 大腸桿菌等細菌為原核生物，細胞內(nèi)沒有對分泌蛋白進行加工修飾的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，而巴斯德畢赤酵母菌為真核生物，其細胞內(nèi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等復(fù)雜的細胞器。所以與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質(zhì)合成后，細胞可以對其進行加工修飾并分泌到細胞外，便于提取。