Question

【題目】下圖1是獲取用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的含人生長(zhǎng)激素基因的DNA片段(DNA復(fù)制子鏈延伸方向是5′→3′，轉(zhuǎn)錄方向?yàn)樽蟆��?示意圖，圖2是所用質(zhì)粒示意圖，其上的Ampr表示青霉素抗性基因，Tett表示四環(huán)素抗性基因。有關(guān)限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)如下表。請(qǐng)據(jù)圖回答：

限制酶識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
識(shí)別序列(5′→3′)	A↓AGCTT	G↓GATCC	C↓TGCAG	G↓AATTC	CCC↓GGG	A↓GATCT

(1) ①過(guò)程催化形成磷酸二酯鍵的酶有____________________，合成的人生長(zhǎng)激素基因中________(選填“有”或“無(wú)”)與終止密碼子相應(yīng)的堿基序列。

(2) 引物1由5′→3′的堿基序列為________________________，引物2應(yīng)含有限制酶________的識(shí)別序列；從圖1的過(guò)程②開(kāi)始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第六次循環(huán)結(jié)束時(shí)，圖中用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的DNA片段所占比例是________。

(3) 在構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程中對(duì)圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成________種環(huán)狀DNA。

(4) 2018年11月基因編輯嬰兒事件震驚了世界，輿論一片嘩然，某科研團(tuán)隊(duì)利用“CRISPR/Cas9”技術(shù)將受精卵中的艾滋病病毒受體基因CCR5進(jìn)行修改，擬培育出具有艾滋病免疫能力的基因編輯嬰兒。下圖3為向?qū)�RNA引導(dǎo)Cas9蛋白切割CCR5基因(目標(biāo)DNA)示意圖。

①向?qū)�RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一種________酶。

②“GRISPR/Cas9”技術(shù)，是利用________法將Cas9蛋白和特定的引導(dǎo)序列導(dǎo)入受精卵中發(fā)揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關(guān)注，很多科學(xué)家表示反對(duì)，請(qǐng)給出合理的理由______________。

Answer 1

【答案】反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶 有 AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 13/16 6 RNA聚合 限制 顯微注射 細(xì)胞內(nèi)DNA上可能不止一個(gè)Cas9酶識(shí)別和切割位點(diǎn)，可能導(dǎo)致脫靶

【解析】

據(jù)圖2可推知，引物1序列應(yīng)包含5′-GCATCCTCCAGG-3′，引物2序列應(yīng)包含5′TAGAGGGACTAC-3′，合成目的基因后需要用限制酶切割，由于目的基因中含有HindⅢ、PstⅠ切點(diǎn)，故用于構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)可選擇的酶只剩下BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ，為防止自身環(huán)化等情況出現(xiàn)，則應(yīng)選擇兩種酶切割，故應(yīng)選擇的酶為BglⅡ、BamHⅠ，最終設(shè)計(jì)的引物應(yīng)在兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，以便將合成的目的基因完整的切割下來(lái)。

（1）①過(guò)程表示逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，催化形成磷酸二酯鍵的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，合成的人生長(zhǎng)激素基因中有與終止密碼子相應(yīng)的堿基序列。

（2）據(jù)分析可知，引物1序列含GCATCCTCCAGG，引物2序列含TAGAGGGACTAC，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)在引物1的5′加上BglⅡ的酶切序列，在引物2的5′加入BamHⅠ酶切序列，因此引物1由5′→3′的堿基序列為AGATCTGCATCCTCCAGG，引物2應(yīng)含有限制酶BamHⅠ的識(shí)別序列；從圖1的過(guò)程②開(kāi)始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第六次循環(huán)結(jié)束時(shí)，根據(jù)圖示和PCR擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)，可以推導(dǎo)出共有6個(gè)DNA的序列雙鏈不等長(zhǎng)，故圖中可用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的DNA片段所占比例是1-6/26=13/16。

（3）在構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程中對(duì)圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后，形成的含有2個(gè)酶切位點(diǎn)的片段有3種，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成6種環(huán)狀DNA。

（4）①向?qū)?/span>RNA的合成需要RNA聚合酶。Cas9蛋白能切割CCR5基因，故Cas9蛋白是一種限制性核酸內(nèi)切酶。

②將外源基因?qū)�入受精卵中�?yīng)選擇顯微注射法，故“GRISPR/Cas9”技術(shù)，是利用顯微注射法將Cas9蛋白和特定的引導(dǎo)序列導(dǎo)入受精卵中發(fā)揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關(guān)注，很多科學(xué)家表示反對(duì)，原因是細(xì)胞內(nèi)DNA上可能不止一個(gè)Cas9酶識(shí)別和切割位點(diǎn)，可能導(dǎo)致脫靶；此外，還存在其他的風(fēng)險(xiǎn)和違背當(dāng)前的倫理道德。