Question

【題目】蜘蛛絲是自然界中機(jī)械性能最好的天然蛋白纖維，其強(qiáng)度高于制作防彈衣的凱夫拉纖維，有廣泛的應(yīng)用前景，但如何大量獲取蜘蛛絲纖維的問題一直未解決。近期，中國科學(xué)家利用基因工程技術(shù)成功的在家蠶絲腺細(xì)胞中大量表達(dá)蜘蛛絲蛋白。

（1）在轉(zhuǎn)基因過程中，若利用圖所示質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要用_____________酶來切割目的基因，該切割方法的優(yōu)點(diǎn)是_____________________________________________

(答出一點(diǎn)即可)。

（2）為獲取大量的蜘蛛絲基因，常采用_______________技術(shù)對該基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增蜘蛛絲基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)__________種引物。進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)需先加熱至90～95℃，加入引物后冷卻至55~60℃，以上調(diào)控溫度操作的目的是____________________。

（3）載體中的啟動子是____________酶的識別結(jié)合位點(diǎn)，以便于驅(qū)動遺傳信息的表達(dá)過程；而載體本身的擴(kuò)增，需借助于載體上的_________________；載體上的標(biāo)記基因的作用是_____________________________。

（4）研究人員發(fā)現(xiàn)若將蛛絲蛋白31號位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50％，這項(xiàng)成果用到的生物工程技術(shù)為____________________________。

Answer 1

【答案】Xba I和Sac I 防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接 PCR 2 使DNA解鏈，然后使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上 RNA聚合酶 復(fù)制原點(diǎn) 重組DNA的鑒別與選擇 蛋白質(zhì)工程

【解析】

1、基因工程的操作步驟包括：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。其中基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟。

基因表達(dá)載體的構(gòu)建：①過程：一般用同一種限制酶切割目的基因和運(yùn)載體，再用DNA連接酶將目的基因和運(yùn)載體連接形成重組DNA分子。②目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并且可以遺傳給下一代并表達(dá)和發(fā)揮作用。③基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因。

（1）啟動子在基因的首段，它是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，能控制著轉(zhuǎn)錄的開始；

（2）終止子在基因的尾端，它控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束；

（3）標(biāo)記基因便于目的基因的鑒定和篩選。

2、PCR擴(kuò)增技術(shù)：PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

（1）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

（2）模板DNA與引 物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。

（3）引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

（1）識圖分析可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，目的基因需要插入到啟動子和終止子之間，圖中啟動子和終止子之間存在Xba I和Sac I的酶切位點(diǎn)，因此需要用Xba I和Sac I限制酶切割目的基因，以產(chǎn)生與質(zhì)粒相同的末端，相比用同一種酶進(jìn)行酶切，用兩種酶切割可以防止目的基因自身環(huán)化或防止目的基因反向連接。

（2）為獲取大量的蜘蛛絲基因，常采用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增蜘蛛絲基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)2種引物分別與2條模板鏈結(jié)合；進(jìn)行PCR時(shí)需加熱至90~95℃然后冷卻至55~60℃，此操作的目的是使DNA解鏈，然后使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上。

（3）基因表達(dá)載體中的啟動子能夠與RNA聚合酶識別和結(jié)合，才能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程，而載體本身的擴(kuò)增，需借助于載體上的復(fù)制原點(diǎn)進(jìn)行，載體上的標(biāo)記基因的作用是鑒別與篩選含有重組DNA的受體細(xì)胞。

（4）研究人員發(fā)現(xiàn)若將蛛絲蛋白31號位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50％，這是對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行的改造，因此利用的是蛋白質(zhì)工程技術(shù)。