Question

【題目】嗜熱菌可以生活在98℃的高溫環(huán)境中，研究發(fā)現(xiàn)其耐熱性與基因H的表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)。下圖表示某研究小組利用大腸桿菌對(duì)H基因?qū)嵭械目寺『捅磉_(dá)過(guò)程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四種限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)分別為CA↓TATG、G↓AATTC、A↓AGCTT、G↓TCGAC。請(qǐng)分析回答：

（1）圖中的結(jié)構(gòu)A是_______，其主要作用是_____________________。一個(gè)完整的基因表達(dá)載體組成，除了質(zhì)粒1中所示結(jié)構(gòu)以外，還應(yīng)該含有_____________________。

（2）用圖中質(zhì)粒1和H基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用________________兩種限制酶進(jìn)行切割，影響限制酶處理效果的因素可能有___________（多選）。

①反應(yīng)溫度 ②緩沖液pH ③限制酶的濃度 ④DNA樣品的純度

（3）實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后H基因的表達(dá)效率很低，但在含有質(zhì)粒2（輔助性質(zhì)粒）的細(xì)胞中，H基因可以高效表達(dá)。為了篩選出轉(zhuǎn)入了兩種質(zhì)粒的受體菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加___________，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)保持_________操作。

（4）PCR反應(yīng)中引物的設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵，據(jù)圖分析，擴(kuò)增H基因時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是_________。

A．引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…

B．引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…

C．引物Ⅰ：…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…

D．引物Ⅰ：…CTCATATG…；引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…

Answer 1

【答案】 啟動(dòng)子 提供RNA聚合酶特異性識(shí)別結(jié)合位點(diǎn) 目的基因、終止子（和復(fù)制原點(diǎn)） NdeⅠ、EcoRⅠ ①②③④ 抗生素A和抗生素B 無(wú)菌 AB

【解析】試題分析：本題結(jié)合基因結(jié)構(gòu)圖和運(yùn)載體結(jié)構(gòu)圖，考查基因工程的技術(shù)和原理，重點(diǎn)是限制酶和DNA連接酶，要求學(xué)生認(rèn)真分析題圖，能根據(jù)圖中信息選擇合適的限制酶，準(zhǔn)確判斷使用DNA連接酶連接的結(jié)果，再運(yùn)用所學(xué)的知識(shí)答題。解答本題的關(guān)鍵是熟記并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知識(shí)網(wǎng)絡(luò)。

（1）據(jù)題圖分析，由質(zhì)粒1的結(jié)構(gòu)、及質(zhì)粒1和重組質(zhì)粒上都具有A可推知，A是啟動(dòng)子，其作用是提供RNA聚合酶特異性識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。一個(gè)完整的基因表達(dá)載體組成包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因，而質(zhì)粒1中已經(jīng)含有啟動(dòng)子和標(biāo)記基因（抗生素A抗性基因），故答案是目的基因、終止子。

（2）結(jié)合四種限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)，確定用圖中質(zhì)粒1和H基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用NdeⅠ、EcoRⅠ兩種限制酶進(jìn)行切割，影響酶的因素都影響限制酶的處理效果，所以可能有溫度、PH、酶濃度和底物的純度，即①②③④。

（3）對(duì)兩種質(zhì)粒的標(biāo)記基因進(jìn)行分析后可知，質(zhì)粒1上含有抗生素A的抗性基因，質(zhì)粒2上含有抗生素B的抗性基因，所以應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加抗生素A和抗生素B。根據(jù)微生物的培養(yǎng)條件可知整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)保持無(wú)菌操作。

（4）分析切割質(zhì)粒和目的基因的兩種限制酶NdeⅠ、EcoRⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)AB選項(xiàng)的引物Ⅱ中有NdeⅠ的識(shí)別序列CA↓TATG，而AB選項(xiàng)的引物Ⅰ中都有EcoRⅠ的識(shí)別序列G↓AATTC，而CD中都不含，所以應(yīng)選擇AB。