Question

【題目】苯丙酮尿癥是由于患者PKU基因突變引起體細胞中缺少一種酶，致使體內的苯丙氨酸代謝異常轉化為苯丙酮酸，從而導致患者神經系統(tǒng)損害。將正常PKU基因定點整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細胞的染色體DNA上來替換突變基因，可用來研究該病的基因治療過程。定點整合的過程是：從染色體DNA上突變PKU基因兩側各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標記基因neor，構建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示。回答下列問題：

（1）上圖中通過基因定點整合可替換特定基因，該技術可用于單基因遺傳病的治療，該技術的應用原理屬于________。該實驗用小鼠胚胎干細胞作為PKU基因的受體細胞以培育出轉基因小鼠，除了胚胎干細胞能大量增殖外，還因為胚胎干細胞________。

（2）實驗中小鼠胚胎發(fā)育到囊胚期時，聚集在胚胎一端，個體較大的細胞是______________，可將其取出并分散成單個細胞進行培養(yǎng)，將來可為實驗提供所需的胚胎干細胞。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液除了一些無機鹽和有機鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動物血清，其中的“兩酸”是指________，培養(yǎng)過程中大部分細胞會貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長，當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為________。

（3）用圖中重組載體轉化胚胎干細胞時，會出現(xiàn)PKU基因錯誤整合。錯誤整合時，載體的兩個K基因中至少會有一個與neor一起整合到染色體DNA上。已知含有neor的細胞具有G418的抗性。 K1、K2的產物都能把DHPG轉化成有毒物質而使細胞死亡。轉化后的胚胎干細胞依次在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來的是________的胚胎干細胞，理由是____________________________。

（4） 將篩選得到的胚胎干細胞培育成小鼠，從個體生物學水平檢測，若小鼠尿液中________，說明PKU基因成功表達。

Answer 1

【答案】基因重組 具有發(fā)育的全能性（全能性） 內細胞團 氨基酸和核苷酸 細胞的接觸抑制（接觸抑制） 正確整合（含neor而不含K基因）（含neor而不含K1或K2基因） 能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉化后的胚胎干細胞中含neor，能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉化后的胚胎干細胞中不含K基因 不含大量苯丙酮酸（苯丙酮酸含量在正常范圍內）

【解析】

DNA重組技術至少需要三種工具：限制性核酸內切酶（限制酶）、DNA連接酶、運載體。構建重組載體時，首先需用限制性核酸內切酶切割目的基因和運載體，再用DNA連接酶連接目的基因和運載體形成重組載體。胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內細胞團），因此獲取的胚胎干細胞應取自囊胚的內細胞團。結合題圖可知，互換后的小鼠染色體DNA，與小鼠染色體DNA比較，HB1和HB2的堿基分別替換成了重組載體的HB1′和HB2′，并且增加了重組載體的neor為新霉素抗性基因，原來突變的PKU基因，替換成了正常的PKU基因。

（1）利用基因工程技術將基因定點整合可替換特定基因，利用的原理是基因重組。胚胎干細胞具有發(fā)育的全能性，且能大量增殖，常被用作受體細胞。

（2）當胚胎發(fā)育到囊胚時期時，聚集在胚胎一端，個體較大的細胞是內細胞團，將來可發(fā)育成胚胎的各種組織。胚胎培養(yǎng)液中除了一些無機鹽和有機鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動物血清，其中的“兩酸”是指氨基酸和核苷酸。動物細胞培養(yǎng)過程會出現(xiàn)貼壁生長，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。

（3）由題意可知，轉化后的各類胚胎干細胞要依次在含有G418和同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在雙重選擇下存活并增值的是正確整合的胚胎干細胞，原因是能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉化后的胚胎干細胞中含neor，能在同時含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉化后的胚胎干細胞中含neor且不含HSV-tk。

（4）苯丙酮尿癥患者體內缺乏一種酶，導致體內苯丙氨酸不能轉化為酪氨酸，而大量轉化為苯丙酮酸，在體內積累，隨尿液排出，若轉基因小鼠的尿液中不含大量苯丙酮酸，說明PKU基因正常表達。