Question

4．β-半乳糖甘酶是一種能夠?qū)⑷樘撬�解成葡萄糖和半乳糖的酶，�?jīng)β-半乳糖甘酶處理過(guò)的奶制品可供乳糖不耐癥患者安全食用．某科研機(jī)構(gòu)為了研發(fā)一種比天然酶活性更高的新型β-半乳糖甘酶，從預(yù)期新型β-半乳糖甘酶的氨基酸序列出發(fā)，推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，并人工合成了兩條80個(gè)堿基的DNA單鏈，兩條鏈通過(guò)16個(gè)堿基
對(duì)形成部分雙鏈DNA片段，再利用K酶補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA，過(guò)程如圖1．

分析回答下列問(wèn)題：
（1）K酶是一種DNA聚合酶，合成的雙鏈DNA有144個(gè)堿基對(duì)．
（2）在利用K酶得到少數(shù)雙鏈DNA分子之后，需要經(jīng)過(guò)PCR獲得更多相同的DNA分子并在基因兩端加上限制酶識(shí)別序列，以便構(gòu)建基因表達(dá)載體．PCR的原理如圖2所示．圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)．
①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第六輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為$\frac{63}{64}$．
②在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段．
③設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一．某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（如圖3），請(qǐng)分別說(shuō)明理由．
第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效；
第2組：兩條引物Ⅱ之間會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效．
（3）某乳業(yè)公司欲獲得含有β-半乳糖苷酶的奶源，研發(fā)人員設(shè)計(jì)了如圖4所示的技術(shù)路線．圖4中kan^R表示卡那霉素抗性基因，amp^R表示氨芐青霉素抗性基因，SmaI、EcoRV、EcoRI直線所示為三種限制酶的酶切位點(diǎn)．
①圖4中將β-半乳糖苷酶基因插入載體，需用EcoRV和EcoRI（填限制酶名稱）限制酶同時(shí)酶切載體和PCR產(chǎn)物，設(shè)計(jì)雙酶切的目的是保證目的基因和載體的定向連接．
②篩選含有重組載體的大腸桿菌需要在含卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行．大腸桿菌是理想的受體細(xì)胞，這是因?yàn)樗�繁殖快、單�?xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少．
③過(guò)程a一般采用的操作技術(shù)是顯微注射法．
④能使β-半乳糖苷酶基因在乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列是A（填字母）．
A．啟動(dòng)子　　　　B．tet^R　　　　C．復(fù)制原點(diǎn)　　　　　D．a(chǎn)mp^R
⑤為檢測(cè)β-半乳糖苷酶基因是否轉(zhuǎn)錄出了探針與雜交，該雜交技術(shù)稱為mRNA，可用標(biāo)記的β-半乳糖苷酶基因片段作探針與mRNA
雜交，該雜交技術(shù)稱為A（填字母）技術(shù)．
A．核酸分子雜交
B．基因序列分析
C．抗原一抗體雜交
D．PCR．

Answer 1

分析 1、基因工程的操作步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定．
2、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制
（2）過(guò)程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成．

解答 解：（1）根據(jù)題意可知，兩條鏈通過(guò)16個(gè)堿基對(duì)形成部分雙鏈DNA片段，再利用K酶補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA，因此K酶是一種DNA聚合酶．由于雙鏈部分含有16個(gè)堿基對(duì)，而人工合成了的DNA單鏈有兩條80個(gè)堿基，因此兩側(cè)各剩余含有64個(gè)堿基組成的單鏈部分，則合成的雙鏈DNA有64×2+16=144個(gè)堿基對(duì)．
（2）①在PCR技術(shù)擴(kuò)增中，只有親代DNA分子的一條母鏈上不存在引物A，因此擴(kuò)增獲得的所有子代DNA分子中只有一個(gè)DNA分子不含引物A．從理論上推測(cè)，經(jīng)過(guò)六輪循環(huán)產(chǎn)生64個(gè)DNA分子，其中含有引物A的DNA片段所占的比例為$\frac{63}{64}$．
②圖中看出，引物的結(jié)合位置均不在DNA鏈的端部，因此經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后產(chǎn)生的兩個(gè)DNA分子都不等長(zhǎng)；在第二次循環(huán)后形成的子鏈中出現(xiàn)固定長(zhǎng)度的DNA鏈，但是形成的四個(gè)DNA分子都不等長(zhǎng)；一直在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段．
③第1組：分析圖中引物可知，引物Ⅰ和引物Ⅱ的堿基之間存在互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，這可能會(huì)導(dǎo)致引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效；
第2組：圖中引物Ⅱ的兩側(cè)堿基具有堿基配對(duì)關(guān)系，因此兩條引物Ⅱ之間會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效．
（3）某乳業(yè)公司欲獲得含有β-半乳糖苷酶的奶源，研發(fā)人員設(shè)計(jì)了如圖4所示的技術(shù)路線．圖4中kan^R表示卡那霉素抗性基因，amp^R表示氨芐青霉素抗性基因，SmaI、EcoRV、EcoRI直線所示為三種限制酶的酶切位點(diǎn)．
①分析題圖可知，圖4中目的基因的兩側(cè)具有EcoRV、EcoRI兩種限制酶的酶切位點(diǎn)，因此將β-半乳糖苷酶基因插入載體，需用EcoRV和EcoRI兩種限制酶同時(shí)酶切載體和PCR產(chǎn)物，從而保證目的基因和載體的定向連接．
②amp^R表示氨芐青霉素抗性基因，圖中看出，利用EcoRV和EcoRI兩種限制酶酶切載體時(shí)，該抗性基因?qū)⑹Щ�，因此篩選含有重組載體的大腸桿菌需要在含卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行．大腸桿菌是理想的受體細(xì)胞，這是因?yàn)樗�繁殖快、單�?xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少．
③在將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞時(shí)，如果受體細(xì)胞為受精卵時(shí)，一般采用顯微注射法．
④能使β-半乳糖苷酶基因在乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)控序列是啟動(dòng)子．
⑤為檢測(cè)β-半乳糖苷酶基因是否轉(zhuǎn)錄出了探針與雜交，該雜交技術(shù)稱為mRNA，可用標(biāo)記的β-半乳糖苷酶基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術(shù)稱為核酸分子雜交技術(shù)．
故答案為：
（1）DNA聚合    144
（2）①$\frac{63}{64}$ 
②三
③引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效    兩條引物Ⅱ之間會(huì)發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效
（3）①EcoRV和EcoRI     保證目的基因和載體的定向連接
②卡那霉素    繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少
③顯微注射法
④A
⑤標(biāo)記的β-半乳糖苷酶基因片段   mRNA    A

點(diǎn)評(píng) 本題綜合考查了基因工程的有關(guān)知識(shí)，要求考生能夠掌握基因工程的操作步驟和工具；能夠提取題圖中有效解題信息，具有一定的難度．