Question

7．限制性核酸內(nèi)切酶（也稱限制酶）是基因工程中常用的工具酶，不同的限制酶用于切割不同的DNA片斷，請據(jù)以下資料回答問題：
（1）某線性DNA分子分別用限制酶HindⅢ和SmaⅠ消化，然后用這兩種酶混合消化，得到如下片段（kb為千個堿基對）：
HindⅢ2.5kb，5.0kb              SmaⅠ2.0kb，5.5kb
HindⅢ和SmaⅠ2.5kb，3.0kb，2.0kb
限制酶HindⅢ和SmaⅠ在此DNA分子中共有一個識別序列．兩酶混合消化的片段再用限制酶EcoRⅠ消化，結(jié)果導致凝膠上3.0kb的片段消失，產(chǎn)生1.5kb的新片段．請指出限制酶EcoRⅠ的切割位點有一個．
（2）現(xiàn)有一長度為1000堿基對（by）的DNA分子，用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000by，說明此DNA分子為環(huán)狀（線性或環(huán)狀），用Kpn1單獨酶切得到400by和600by兩種長度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時酶切后得到200by和600by兩種長度的DNA分子．該DNA分子的酶切圖譜是（要求寫出酶名稱并標明長度）
（3）基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的關(guān)鍵步驟之一，已知有4種限制酶，其中1號和4號切割DNA后產(chǎn)生的是平末端，2號和3號酶切產(chǎn)生的是黏性末端．含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒的酶切序列如圖所示：

請設(shè)計一個酶切方案，構(gòu)建最佳基因表達載體（重組質(zhì)粒）：目的基因用2和4兩種酶切；而質(zhì)粒用1和2 兩種酶切割，再用DNA連接酶進行連接．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
2、基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
3、將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）線性DNA分子在限制酶HindⅢ的切割下形成2.5kb和5.0kb的片段，因此限制酶HindⅢ在該DNA分子上具有一個酶切位點；同理可得，限制酶SmaⅠ在該DNA分子上也具有一個酶切位點．兩種酶同時切割時，根據(jù)所得片段可以判斷，限制酶HindⅢ的酶切位點在DNA分子左側(cè)的2.5kb處，限制酶SmaⅠ的酶切位點在DNA分子右側(cè)的2.0kb處，中間剛好有個3.0kb的片段．再用限制酶EcoRⅠ處理，結(jié)果導致凝膠上3.0kb的片段消失，產(chǎn)生一個1.5kb的新片段，說明限制酶EcoRⅠ的酶切位點就在3.0kb片段的中間位置，如圖，切點有1個．
（2）由于DNA分子用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，說明此DNA分子為環(huán)狀DNA．用Kpn1單獨酶切，得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子片段，說明該酶在該DNA分子上具有兩個切點；用EcoRI、Kpnl同時酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子片段，說明EcoRI的切點剛好在400bp片段的中間，由此畫圖即可．
（3）目的基因用酶2和4切割，質(zhì)粒用酶1和2切割，由于1和4切出的是平末端，可以相連，因而目的基因可以與質(zhì)粒重組，且又能防止自身環(huán)化．
故答案為：
（1）一   一
（2）環(huán)狀、
（3）2和4  1和2

點評 本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的原理、使用的工具及操作步驟，掌握各步驟中應注意的細節(jié)，再結(jié)合所學的知識準確答題，屬于考綱理解和應用層次的考查．