Question

【題目】科研工作者利用胚胎干細胞和基因敲除技術(shù)改造老鼠體內(nèi)的特定靶基因，使實驗鼠體內(nèi)的靶基因失去作用，從而發(fā)現(xiàn)這些基因的實際功能，這種技術(shù)的應(yīng)用，使我們能夠更深入地了解胚胎發(fā)育、老化以及疾病的過程�；�因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段（部分序列與靶基因相同，從而使該片段特異性插入靶基因）使靶基因突變而達到基因敲除的目的。原理如圖：

科研工作者獲取穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除小鼠一般經(jīng)歷下列過程：

（1）獲取干細胞懸浮液

科學(xué)家將動物胚胎組織用_____________處理使其細胞離散 ，再通過CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)胚胎干細胞。CO2的作用是_________________；胚胎干細胞分化為不同組織器官的原因是 __________________________________。

（2）構(gòu)建重組DNA分子

構(gòu)建含有“同源性片段”的重組DNA分子時要用到的工具酶有________________；該實驗病毒的作用是_____________。

（3）獲取含重組基因的干細胞

基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低（動物的重組概率為10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的標記基因作用非常重要，可采用__________________技術(shù)檢測或利用選擇培養(yǎng)基篩選。靶基因被插入同源性片段后發(fā)生基因突變，該特異性插入突變克服了自然誘發(fā)突變或人工物理、化學(xué)誘發(fā)突變的______________特點，便于專一性研究靶基因的功能。

（4）將重組的胚胎干細胞通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚泡（囊胚中），然后將胚泡植入受體小鼠子宮中，獲取子代嵌合體小鼠。其中一些子代小鼠的配子不含無活性基因，原因可能是____________________（答出2點）。X代中含有無活性基因的雌鼠和雄鼠均為_________________。

（5）獲取基因敲除純合子小鼠

假設(shè)已獲取1只雌性基因敲除雜合子小鼠。用遺傳圖解表示利用該鼠通過雜交實驗獲得純合基因敲除小鼠的過程。（靶基因用A表示，插入同源片段的靶基因用A+表示 ）

________________________

Answer 1

【答案】 胰蛋白酶 調(diào)節(jié)pH 基因的選擇性表達 限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶 載體 DNA分子雜交 隨機性和不定向性 子代小鼠可能為雜合子； 重組胚胎干細胞未分化為精原細胞或卵原細胞 雜合子

【解析】試題分析：基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的，由此可見，基因敲除可定向改變生物體的某一基因，基因敲除既可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正�；�因，也可以用正�；�因敲除相應(yīng)的突變基因，因此利用基因敲除技術(shù)可以修復(fù)細胞中的病變基因來治療基因遺傳病，但不能治療染色體異常遺傳病。

（1）動物細胞培養(yǎng)時，應(yīng)用胰蛋白酶處理胚胎組織使其分散成單個細胞，動物細胞培養(yǎng)時的氣體環(huán)境是95%的空氣+5%二氧化碳的混合氣體，CO2起到調(diào)節(jié) PH值作用。胚胎干細胞具有分裂和分化能力，能分化成不同組織器官，原因是基因的選擇性表達。

（2）構(gòu)建同源性片段的重組DNA分子時，先要使用限制性內(nèi)切酶對供體基因和運載體進行切割，然后再使用DNA連接酶連接，形成重組DNA分子，在使用病毒將重組DNA分子運入到受體細胞，因此該病毒的作用是載體。

（3）標記基因的作用是鑒別受體細胞是否含有目的基因，檢測 受體細胞中的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。靶基因被插入同源性片段后發(fā)生基因突變，該特異性插入突變克服了自然誘發(fā)突變或人工物理、化學(xué)誘發(fā)突變的隨機性和不定向性特點，便于專一性研究靶基因的功能。

（4）重組的胚胎干細胞通過顯微注射技術(shù)導(dǎo)入胚泡，獲取子代嵌合體小鼠，一些子代小鼠的配子不含無活性基因，原因可能是子代小鼠可能為雜合子或重組胚胎干細胞未分化為精原細胞或卵原細胞，由于正常小鼠中不含有同源片段的靶基因，因此X代中含有無活性基因的雌鼠和雄鼠均為雜合子。

（5）雌性基因敲除雜合子小鼠基因型為AA+，可利用該鼠與基因型為AA的雄鼠雜交，獲得子一代基因型為AA+雌雄小鼠再交配，可獲得基因敲除純合子小鼠（即A+A+）。遺傳圖如下：