Question

8．轉(zhuǎn)運(yùn)肽能引導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體和葉綠體，增強(qiáng)相關(guān)細(xì)胞器的功能．為增加油菜籽的含油量，研究人員分別從陸地棉和擬南芥中克隆了酶N基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因，并連接形成融合基因，將其導(dǎo)入油菜后，獲得了高油轉(zhuǎn)基因油菜．
（1）在已知酶N基因、轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因的上游及下游堿基序列的情況下，可人工設(shè)計(jì)合成引物用于和模板單鏈結(jié)合，作為多聚核苷酸鏈延伸的起點(diǎn)．在PCR擴(kuò)增中所需的關(guān)鍵酶是Taq酶．
（2）酶N基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因的限制酶切點(diǎn)如圖1，形成融合基因前，應(yīng)用限制酶SacI處理兩個(gè)基因，再用DNA連接酶連接成融合基因．

（3）Ti質(zhì)粒存在于農(nóng)桿菌中，構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)將上述融合基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，所用的限制酶為ClaI、Xba．目的基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌時(shí)，將農(nóng)桿菌接種在含四環(huán)素的平板上培養(yǎng)得到含融合基因的單菌落，再經(jīng)純培養(yǎng)得到浸染液
（4）浸染液中農(nóng)桿菌在感染油菜時(shí)，將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞并整合到染色體DNA上，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)化．利用放射性物質(zhì)標(biāo)記的基因（融合基因或酶N基因及轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因）、抗體進(jìn)行分子雜交，通過檢測(cè)雜交帶的有無，可判斷融合基因是否穩(wěn)定的存在和表達(dá)．

Answer 1

分析 1、基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、cDNA文庫和基因文庫的比較表：

文庫類型	cDNA	基因組文庫
文庫大小	小	大
基因中啟動(dòng)子	無	有
基因中內(nèi)含子	無	有
基因多少	某種生物的部分基因	某種生物的全部基因
物種間的基因交流	可以	部分基因可以

解答 解：（1）在已知酶N基因、轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因的上游及下游堿基序列的情況下，可人工設(shè)計(jì)合成引物用于和模板單鏈結(jié)合，作為多聚核苷酸鏈延伸的起點(diǎn)．在PCR擴(kuò)增中所需的關(guān)鍵酶是Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶）．
（2）酶N基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因的一端都有限制酶 Sac I的識(shí)別序列，因此形成融合基因前，應(yīng)用限制酶Sac I處理兩個(gè)基因，以形成相同的黏性末端，再用DNA連接酶連接成融合基因．
（3）融合基因一端有限制酶Cla I的識(shí)別序列，另一端有限制酶Xba的識(shí)別序列，因此構(gòu)建目的基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)將上述融合基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，所用的限制酶為Cla I、Xba．由圖可知，標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因，因此目的基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌時(shí)，將農(nóng)桿菌接種在含四環(huán)素的平板上培養(yǎng)得到含融合基因的單菌落，再經(jīng)純培養(yǎng)得到浸染液
（4）浸染液中農(nóng)桿菌在感染油菜時(shí)，將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞并整合到染色體DNA上，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)化．利用放射性物質(zhì)標(biāo)記的基因（融合基因或酶N基因及轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因）、抗體進(jìn)行分子雜交，通過檢測(cè)雜交帶的有無，可判斷融合基因是否穩(wěn)定的存在和表達(dá)．
故答案為：
（1）引物   Taq酶
（2）Sac I   DNA連接酶
（3）T-DNA     Cla I、Xba      四環(huán)素
（4）轉(zhuǎn)化      放射性物質(zhì)標(biāo)記的基因（融合基因或酶N基因及轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因）、抗體

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)問題，能結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題．