Question

3．圖甲表示某細(xì)菌的質(zhì)粒中相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)，圖乙表示目的基因所在的DNA中相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)．請(qǐng)分析并回答下列問題：

（1）用Sma l限制酶處理圖甲所示的質(zhì)粒會(huì)得到2個(gè)DNA片段，用AluⅠ處理圖乙所示的外源DNA會(huì)增加2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)．
（2）為了避免目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的片段發(fā)生自身環(huán)化或任意連接，以及便于篩選需要，在實(shí)際操作中，一般應(yīng)選用PstI和HindⅢ（填限制酶名稱）同時(shí)酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA．再用DNA連接酶處理．如果是用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，設(shè)計(jì)引物是關(guān)鍵，但在擴(kuò)增時(shí)退火溫度一般為55℃一60℃，對(duì)于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時(shí)一般用60℃，原因是G與C（之間是三個(gè)氫鍵）比例越高越穩(wěn)定[或A與T（之間是二個(gè)氫鍵）比例越高越不穩(wěn)定]．
（3）為了篩選獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)人員首先將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理過的大腸桿菌接種在含四環(huán)素（抗生素）的培養(yǎng)基中，然后用影印法將該培養(yǎng)基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素（抗生素）培養(yǎng)基上，以篩選獲得含重組質(zhì)粒的細(xì)菌．在含四環(huán)素培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)繁殖，而在含氯霉素培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)繁殖的是導(dǎo)人了重組質(zhì)粒（或目的基因）的大腸桿菌．

（4）經(jīng)檢測(cè)：在上述導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉(zhuǎn)錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質(zhì)卻并不具有生物活性，最可能的原因是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統(tǒng)），不能對(duì)多肽鏈進(jìn)行加工（折疊、組裝與修飾）．

Answer 1

分析 分析題圖：外源DNA含有四個(gè)酶切位點(diǎn)，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點(diǎn)位于目的基因上，所以不能用此酶切割；質(zhì)粒也含有SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶的酶切位點(diǎn)，但用SmaⅠ酶切割會(huì)將質(zhì)粒上兩個(gè)標(biāo)記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；所以構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時(shí)酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA．用 PstⅠ和HindⅢ酶同時(shí)酶切質(zhì)粒，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，所以導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，但不能抗癌變青霉素．

解答 解：（1）質(zhì)粒上含有兩個(gè)SmaⅠ限制酶的切割位點(diǎn)，所以用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質(zhì)粒會(huì)得到2個(gè)DNA片段；圖乙所示的外源DNA含有一個(gè)AluⅠ限制酶的切割位點(diǎn)，所以用AluⅠ處理外源DNA會(huì)形成兩個(gè)黏性末端，增加2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)．
（2）外源DNA含有四個(gè)酶切位點(diǎn)，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點(diǎn)位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割會(huì)將質(zhì)粒上兩個(gè)標(biāo)記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；應(yīng)選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時(shí)酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA，這樣可以避免目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的片段發(fā)生自身環(huán)化或任意連接，也便于篩選需要．如果是用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，設(shè)計(jì)引物是關(guān)鍵，但在擴(kuò)增時(shí)退火溫度一般為55～60℃，對(duì)于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時(shí)一般用60℃，原因是G與C之間是三個(gè)氫鍵，所以C和G比例越高，DNA越穩(wěn)定．
（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同時(shí)酶切質(zhì)粒，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，所以導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，但不能抗癌變青霉素．為了篩選獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，首先將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理過的大腸桿菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，然后用影印法將該培養(yǎng)基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素培養(yǎng)基上，以篩選獲得含重組質(zhì)粒的細(xì)菌．在含四環(huán)素培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)繁殖，而在含氯霉素培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)繁殖的是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌．
（4）因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體，不能對(duì)多肽鏈進(jìn)行折疊、組裝與修飾，所以在上述導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉(zhuǎn)錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質(zhì)卻并不具有生物活性．
故答案為：
（1）2   2
（2）PstI和HindⅢG與C（之間是三個(gè)氫鍵）比例越高越穩(wěn)定[或A與T（之間是二個(gè)氫鍵）比例越高越不穩(wěn)定]
（3）四環(huán)素    氯霉素     重組質(zhì)粒（或目的基因）
（4）大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統(tǒng)），不能對(duì)多肽鏈進(jìn)行加工（折疊、組裝與修飾）

點(diǎn)評(píng) 本題以圖為載體，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作步驟及相關(guān)細(xì)節(jié)，掌握基因工程技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用，能結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱識(shí)記和理解層次的考查．