Question

回答下列有關(guān)基因工程的問題．
肺細(xì)胞中的let-7基因表達(dá)減弱，癌基因RAS表達(dá)增強(qiáng)，會引發(fā)肺癌．研究人員利用基因工程技術(shù)將let-7基因?qū)�入肺癌�?xì)胞實(shí)現(xiàn)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖受到抑制．該基因工程技術(shù)基本流程如圖1．

（1）進(jìn)行過程①時(shí)，需用

 

酶切開載體以插入let-7基因．
（2）進(jìn)行過程 ②時(shí)，需用

 

酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞，以利于細(xì)胞培養(yǎng)．
（3）研究發(fā)現(xiàn)，let-7基因能影響癌基因RAS的表達(dá)，其影響機(jī)理如圖2．據(jù)圖分析，可從細(xì)胞中提取

 

進(jìn)行分子雜交，以直接檢測let-7基因是否轉(zhuǎn)錄．肺癌細(xì)胞增殖受到抑制，可能是由于細(xì)胞中

 

（RASmRNA/RAS蛋白質(zhì)）含量減少引起的．
（4）某線性DNA分子分別用限制酶HindⅢ和SmaⅠ處理，然后用這兩種酶同時(shí)處理，得到如下片段（kb為千個(gè)堿基對）：
HindⅢ：2.5kb，5.0kb；             SmaⅠ：2.0kb，5.5kb；
HindⅢ和SmaⅠ：2.5kb，3.0kb，2.0kb；
限制酶HindⅢ和SmaⅠ在此DNA分子中各有

 

個(gè)識別序列．
兩酶同時(shí)處理后得到的片段，再用限制酶EcoRⅠ處理，結(jié)果導(dǎo)致凝膠上3.0kb的片段消失，產(chǎn)生一個(gè)1.5kb的新片段．將該DNA分子內(nèi)部的限制酶HindⅢ、SmaⅠ、EcoRⅠ的切割位點(diǎn)標(biāo)注在答題紙的指定位置．

 

．
（5）現(xiàn)有一長度為1000堿基對（bp）的DNA分子，用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，說明此DNA分子為

 

（線性或環(huán)狀）．用Kpn1單獨(dú)酶切，得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子片段；用EcoRI、Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子片段．該DNA分子的酶切圖譜是

 

．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的應(yīng)用

專題：

分析：圖1表示利用基因工程技術(shù)將let-7基因?qū)�入肺癌�?xì)胞，然后利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)肺癌細(xì)胞．
圖2可以看出，let-7基因能夠轉(zhuǎn)錄通過加工產(chǎn)生無翻譯功能的miRNA，該分子能夠與RAS基因轉(zhuǎn)錄的RASmRNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，從而影響癌基因RAS的表達(dá)．
在確定酶切位點(diǎn)時(shí)，首先要根據(jù)切割片段判斷有幾個(gè)切點(diǎn)，然后再綜合考慮即可．

解答： 解：（1）過程①表示基因工程操作步驟中基因表達(dá)載體的構(gòu)建，在該過程中需要用限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）對載體進(jìn)行切割，以便于目的基因的插入；啟動子是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，RNA聚合酶結(jié)合到該位點(diǎn)，可驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程．
（2）過程②表示動物細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象后，可以用胰蛋白酶處理，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，隨后分裝到新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)．
（3）判斷目的基因是否在受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，可用分子雜交技術(shù)來檢測，從細(xì)胞中提取mRNA和用放射性同位素或者熒光標(biāo)記的目的基因單鏈DNA片段進(jìn)行雜交．據(jù)圖2可知，let-7基因影響RAS基因表達(dá)的機(jī)理是：let-7基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA與RAS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RAS mRNA結(jié)合，使RAS基因翻譯受到抑制，引起細(xì)胞中的RAS蛋白含量減少，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖受到抑制．
（4）線性DNA分子在限制酶HindⅢ的切割下形成2.5kb和5.0kb的片段，因此限制酶HindⅢ在該DNA分子上具有一個(gè)酶切位點(diǎn)；同理可得，限制酶SmaⅠ在該DNA分子上也具有一個(gè)酶切位點(diǎn)．兩種酶同時(shí)切割時(shí)，根據(jù)所得片段可以判斷，限制酶HindⅢ的酶切位點(diǎn)在DNA分子左側(cè)的2.5kb處，限制酶SmaⅠ的酶切位點(diǎn)在DNA分子右側(cè)的2.0kb處，中間剛好有個(gè)3.0kb的片段．再用限制酶EcoRⅠ處理，結(jié)果導(dǎo)致凝膠上3.0kb的片段消失，產(chǎn)生一個(gè)1.5kb的新片段，說明限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)就在3.0kb片段的中間位置．
（5）由于DNA分子用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，說明此DNA分子為環(huán)狀DNA．用Kpn1單獨(dú)酶切，得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子片段，說明該酶在該DNA分子上具有兩個(gè)切點(diǎn)；用EcoRI、Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子片段，說明EcoRI的切點(diǎn)剛好在400bp片段的中間，由此畫圖即可．
故答案為：
（1）限制性核酸內(nèi)切酶；
（2）胰蛋白；
（3）RNA、RAS蛋白質(zhì)；

（4）一   
（5）環(huán)狀、

點(diǎn)評：本題主要考查學(xué)生基因工程、細(xì)胞工程的相關(guān)知識，意在使學(xué)生能理解所學(xué)知識的要點(diǎn)，把握知識間的內(nèi)在聯(lián)系，形成知識的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)．