Question

【題目】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列問題：

限制酶	BamH	Bcl	Sau3A	HindⅢ
識別序列及切割位點(diǎn)	G↓GATCC CCTAG↑G	T↓GATCA ACTAG↑T	↓GATC CTAG↑	A↓AGCTT TTCGA↑A

（1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用________和______兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。

（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為_______，對于該部位，這兩種酶_______(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。

（4）若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。

Answer 1

【答案】BclⅠ HindⅢ DNA連接 感受 四環(huán)素 引物甲和引物丙 都不能 7

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

1、目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

4、目的基因的檢測與鑒定：

（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原——抗體雜交技術(shù)。

（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割。酶切后的載體和目的基因片段，通過連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌。

（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙。

（3）根據(jù)BamHⅠ和BclI的酶切位點(diǎn)，若BamHI酶切的DNA末端與BclI酶切的DNA末端連接，則連接部位的6個堿基對序列為，對于該部位，由于與兩種酶的酶切位點(diǎn)均不同，故這兩種酶都不能切開。

（4）根據(jù)BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位點(diǎn)，Sau3A I在質(zhì)粒上有三個酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。