Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）平板澆注法是常用的菌種分離純化方法，是將待分離的樣品用無菌水作梯度系列稀釋后，取合適稀釋度的少量菌懸液加至無菌培養(yǎng)皿中，立即倒入融化的固體培養(yǎng)基，經(jīng)充分混勻后，置室溫下培養(yǎng)。下圖是研究人員用平板澆注法從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，并進(jìn)行大量培養(yǎng)的操作流程，請(qǐng)回答下列問題：

（1）為分離培養(yǎng)該酵母菌，配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)以___________為唯一碳源，按照培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，及時(shí)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，并進(jìn)行_____________滅菌。

（2）取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標(biāo)記好的無菌培養(yǎng)皿中，在步驟③中將溫度約__________（在25℃、50℃或80℃（3個(gè)中選擇）的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基的 _____________部位出現(xiàn)許多單菌落。

（3）挑取平板中長出的單菌落，按步驟④所示進(jìn)行劃線分離。下列敘述不合理的是_______。

A．為保證無菌操作，接種環(huán)使用前必須進(jìn)行灼燒滅菌

B．劃線時(shí)應(yīng)避免劃破培養(yǎng)基表面，以免不能形成正常菌落

C．挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)菌落，分別測(cè)定酵母細(xì)胞中甲醇的含量

D．可以通過逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株

（4）步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和____________供應(yīng)。為監(jiān)測(cè)酵母的細(xì)胞密度，將發(fā)酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)5個(gè)中格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞的個(gè)數(shù)應(yīng)不少于_____________，才能達(dá)到每毫升至少含2×109個(gè)細(xì)胞的預(yù)期密度。

（二）回答與基因工程及其應(yīng)用有關(guān)的問題：

（1）博耶（H．Boyer）和科恩（S．Coben）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，該研究除證明了質(zhì)�？梢宰鳛檩d體外，還證明了_____________________（答出兩點(diǎn)即可）。

（2）體外重組的質(zhì)�？赏ㄟ^Ca2+參與的方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是___________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止大腸桿菌內(nèi)的蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用___________的大腸桿菌作為受體細(xì)胞。在提取純化蛋白質(zhì)的過程中應(yīng)添加________，防止目的蛋白質(zhì)被降解。

Answer 1

【答案】甲醇 高壓蒸汽 50℃ 表層和內(nèi)部 C 氧氣 160 體外重組的質(zhì)�？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá) 外殼蛋白（或答噬菌體蛋白） 細(xì)菌 蛋白酶缺陷型 蛋白酶

【解析】

1、稀釋涂布平板法在培養(yǎng)基上分離、培養(yǎng)出微生物的單個(gè)菌落，以便于計(jì)數(shù)、移植、分離，從而達(dá)到純化培養(yǎng)的目的。

2、選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，那么培養(yǎng)基中要加入甲醇，且是唯一碳源。

3、據(jù)圖分析，①稱量土樣，里面含有需要分離的酵母菌；②表示梯度稀釋，③④表示平板劃線法，進(jìn)行純化培養(yǎng)；⑤表示擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得更多的酵母菌。

4、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）要想從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)以甲醇為唯一碳源，按照培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，及時(shí)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分裝，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

（2）倒平板時(shí)，培養(yǎng)基需要冷卻到50℃左右才能用來倒平板，所以在步驟③中應(yīng)將溫度約50℃的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。由于酵母菌為兼性厭氧型，所以經(jīng)培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基的表層和內(nèi)部部位出現(xiàn)單菌落。

（3）A、接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌，做到無菌操作，A正確；

B、劃線時(shí)應(yīng)避免劃破培養(yǎng)基表面，否則大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，B正確；

C、挑取菌落時(shí)，應(yīng)挑取多個(gè)菌落，分別測(cè)定培養(yǎng)液中甲醇的含量，C錯(cuò)誤；

D、可以通過逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株，D正確。

故選C。

（4）有氧呼吸能為酵母菌的繁殖提供大量能量，所以步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，以促進(jìn)有氧呼吸，進(jìn)而大量繁殖。假設(shè)理論上5個(gè)中方格的活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于n才能達(dá)到每毫升2×109個(gè)活細(xì)胞的預(yù)期密度，根據(jù)“將發(fā)酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)”，可列式為25÷5×n÷0.4×1000×1000=2×109，解得n=160，所以5個(gè)中方格中酵母菌數(shù)不少于160。

（二）（1）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，說明體外重組的質(zhì)�？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞；也可說明真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)。

（2）噬菌體為DNA病毒，由DNA和蛋白質(zhì)組成，所以體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質(zhì)外殼組裝才能形成完整噬菌體。噬菌體屬于細(xì)菌病毒，宿主細(xì)胞只能是細(xì)菌，所以在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是細(xì)菌。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解，為防止蛋白質(zhì)被降解，選擇的大腸桿菌體內(nèi)應(yīng)該沒有可以降解蛋白質(zhì)的酶，所以選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加蛋白酶的抑制劑。