Question

【題目】對棉纖維基因GhRACK1的正常啟動子P進(jìn)行改造，獲得了P1、P2、P3、P4缺失體�？蒲腥藛T對正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

（1）首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增正常啟動子P，方法如圖1。

①不能直接根據(jù)片段Ⅰ擴(kuò)增出正常啟動子P，因?yàn)?/span>__。

②利用__酶處理使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA。

③將環(huán)狀DNA用__酶處理，得到片段Ⅱ．欲擴(kuò)增出正常啟動子P，需選用的引物組合為__。

（2）利用有關(guān)酶對正常啟動子P進(jìn)行切割，得到不同程度缺失體（P1﹣P4），圖2表示正常啟動子P缺失示意圖。

（3）利用正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）分別構(gòu)建了基因表達(dá)盒，如圖3所示。

（4）再將5種基因表達(dá)盒分別轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒，構(gòu)建相應(yīng)的植物表達(dá)載體。然后將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌，最后導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。用含有__的培養(yǎng)基對煙草細(xì)胞進(jìn)行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）的轉(zhuǎn)基因煙草。將植物組織浸入適量__溶液中，觀察煙草細(xì)胞gus基因是否表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。

	根	葉	花粉
正常啟動子P	幼根+根毛+	﹣	﹣
P1	+	+	+
P2	+	+	+
P3	+	+	+
P4	+	+	+

有藍(lán)色：+ 無藍(lán)色：﹣

如果煙草細(xì)胞gus基因成功表達(dá)，則細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明__。

與P1﹣P4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，說明正常啟動子P發(fā)揮不同功能的關(guān)鍵序列位于圖2的__。（填字母）

Answer 1

【答案】正常啟動子P左側(cè)序列未知 Bgl II和DNA連接 Msc I C和B 卡那霉素 X﹣Gluc 正常啟動子P驅(qū)動gus基因在幼根及根毛中特異性表達(dá)，而缺失體中gus基因在根、葉和花粉均表達(dá) M、Q

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定。

a.分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA﹣﹣分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)﹣﹣抗原﹣抗體雜交技術(shù)。

b.個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）①利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的前提條件是要有已知核苷酸序列的目的基因，但正常啟動子P左側(cè)序列未知，因此不能直接根據(jù)片段Ⅰ擴(kuò)增出正常啟動子P。

②根據(jù)圖1中環(huán)狀DNA分子中的酶切位點(diǎn)可知，要得到環(huán)狀DNA分子時(shí)，首先利用Bgl II酶切割片段Ⅰ，再用DNA連接酶處理使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA。

③根據(jù)圖1可知，將環(huán)狀DNA用Msc I酶處理，得到片段Ⅱ。PCR反應(yīng)中是從引物的3‘端開始合成新DNA鏈的，因此欲擴(kuò)增出正常啟動子P，需選用的引物組合為C和B。

（4）根據(jù)圖3可知，標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因，因此導(dǎo)入煙草細(xì)胞中后，用含有卡那霉素的培養(yǎng)基對煙草細(xì)胞進(jìn)行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1﹣P4）的轉(zhuǎn)基因煙草。由于gus基因表達(dá)產(chǎn)物可將X﹣Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，因此將植物組織浸入適量X﹣Gluc溶液中，觀察煙草細(xì)胞gus基因是否表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正常啟動子P驅(qū)動gus基因在幼根及根毛中特異性表達(dá)，而缺失體中gus基因在根、葉和花粉均表達(dá)；與P1﹣P4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，說明正常啟動子P發(fā)揮不同功能的關(guān)鍵序列位于圖2的M、Q。