Question

7．對棉纖維基因GhRACK1的正常啟動子P進行改造，獲得了P1、P2、P3、P4缺失體．科研人員對正常啟動子P及其4種缺失體（P1-P4）進行了實驗研究．
（1）首先利用PCR技術(shù)擴增正常啟動子P，方法如圖1．

①不能直接根據(jù)片段Ⅰ擴增出正常啟動子P，因為正常啟動子P左側(cè)序列未知．
②利用Bgl II和DNA連接酶處理使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA．
③將環(huán)狀DNA用Msc I酶處理，得到片段Ⅱ．欲擴增出正常啟動子P，需選用的引物組合為C和B．
（2）利用有關(guān)酶對正常啟動子P進行切割，得到不同程度缺失體（P1-P4），圖2表示正常啟動子P缺失示意圖．

（3）利用正常啟動子P及其4種缺失體（P1-P4）分別構(gòu)建了基因表達盒，如圖3所示．

（4）再將5種基因表達盒分別轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒，構(gòu)建相應(yīng)的植物表達載體．然后將其導入農(nóng)桿菌，最后導入煙草細胞中．用含有卡那霉素的培養(yǎng)基對煙草細胞進行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1-P4）的轉(zhuǎn)基因煙草．將植物組織浸入適量X-Gluc溶液中，觀察煙草細胞gus基因是否表達，實驗結(jié)果如下表．

	根	葉	花粉
正常啟動子P	幼根+根毛+	-	-
P1	+	+	+
P2	+	+	+
P3	+	+	+
P4	+	+	+

有藍色：+無藍色：-
如果煙草細胞中g(shù)us基因成功表達，則細胞呈現(xiàn)藍色．實驗結(jié)果表明正常啟動子P驅(qū)動gus基因在幼根及根毛中特異性表達，而缺失體中g(shù)us基因在根、葉和花粉均表達．
與P1-P4的實驗結(jié)果相比，說明正常啟動子P發(fā)揮不同功能的關(guān)鍵序列位于圖2的M、Q．（填字母）

Answer 1

分析 1、解答本題的關(guān)鍵是能正確分析圖中和表中信息，從中提取有效信息準確答題．
2、基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）①利用PCR技術(shù)擴增DNA的前提條件是要有已知核苷酸序列的目的基因，但正常啟動子P左側(cè)序列未知，因此不能直接根據(jù)片段Ⅰ擴增出正常啟動子P．
②根據(jù)圖1中環(huán)狀DNA分子中的酶切位點可知，要得到環(huán)狀DNA分子時，首先利用Bgl II酶切割片段Ⅰ，再用DNA連接酶處理使片段Ⅰ成為環(huán)狀DNA．
③根據(jù)圖1可知，將環(huán)狀DNA用Msc I酶處理，得到片段Ⅱ． PCRPCR反應(yīng)中是從引物的3‘端開始合成新DNA鏈的，因此欲擴增出正常啟動子P，需選用的引物組合為C和B．
（4）根據(jù)圖3可知，標記基因是卡那霉素抗性基因，因此導入煙草細胞中后，用含有卡那霉素的培養(yǎng)基對煙草細胞進行篩選，分別獲得了含有正常啟動子P及其4種缺失體（P1-P4）的轉(zhuǎn)基因煙草．由于gus基因表達產(chǎn)物可將X-Gluc水解生成藍色產(chǎn)物，因此將植物組織浸入適量X-Gluc溶液中，觀察煙草細胞gus基因是否表達．實驗結(jié)果表明正常啟動子P驅(qū)動gus基因在幼根及根毛中特異性表達，而缺失體中g(shù)us基因在根、葉和花粉均表達．與P1-P4的實驗結(jié)果相比，說明正常啟動子P發(fā)揮不同功能的關(guān)鍵序列位于圖2的M、Q．
故答案為：
（1）正常啟動子P左側(cè)序列未知         Bgl II和DNA連接       Msc I     C和B
（4）卡那霉素      X-Gluc       正常啟動子P驅(qū)動gus基因在幼根及根毛中特異性表達，而缺失體中g(shù)us基因在根、葉和花粉均表達      M、Q

點評 本題結(jié)合圖表，考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的概念、原理、操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節(jié)，能結(jié)合所學的知識準確答題．