Question

【題目】人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。下圖為“轉(zhuǎn)基因酵母乙肝疫苗”的生產(chǎn)過程示意圖，該過程所用酵母菌為畢赤酵母菌，其體內(nèi)無天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了下圖所示的pPIC9K質(zhì)粒（松弛控制型，復(fù)制不受宿主細(xì)胞控制）用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合與染色體組已實(shí)現(xiàn)表達(dá)。請回答下列問題：

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上限制酶_________的識別序列，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是可避免質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化。步驟1應(yīng)選用___________（填“Ecoli”或“T4”）DNA連接酶。

（2）步驟2的目的是______________________。已知大腸桿菌每20分鐘分裂一次，若1個大腸桿菌中導(dǎo)入了 10個重組質(zhì)粒，則1小時(shí)后可從1個大腸桿菌的后代中得到重組質(zhì)粒的個數(shù)___________。

（3）步驟4中應(yīng)選用限制酶___________切割重組質(zhì)粒以獲得一段線性DNA，然后將其導(dǎo)入畢赤酵母菌細(xì)胞。為了確認(rèn)畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入___________以便篩選。除此以外，還可以用分子雜交技術(shù)鑒定上圖中的畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，過程如下圖所示:

根據(jù)圖中顯示結(jié)果推算，若要獲得16個成功導(dǎo)入該基因的酵母菌菌落，則上圖中的酵母菌菌落數(shù)至少要為___________個。

（4）已知質(zhì)粒在細(xì)胞傳代過程中有丟失現(xiàn)象，試分析畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性高于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主要原因_________________________________。

Answer 1

【答案】 SnaBr和AvrⅡ T4 獲得大量重組質(zhì)粒（擴(kuò)增） 不確定 BglⅡ 卡拉霉素 120 目的基因整合到酵母染色體上，不易丟失

【解析】試題分析：重組質(zhì)粒上的目的基因若要表達(dá)，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子。分析題圖，圖中質(zhì)粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位點(diǎn)，其中SacⅠ位于啟動子上，BglⅡ不在啟動子與終止子之間，因此要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，同時(shí)防止自身環(huán)化，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割質(zhì)粒，則應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列。

（1）根據(jù)以上分析已知，在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列；根據(jù)表格分析可知，SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶切割后漏出的分別是平末端和粘性末端，因此步驟1構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)該用T4 DNA連接酶。

（2）步驟2將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，讓其在大腸桿菌體內(nèi)復(fù)制，以獲得大量的重組質(zhì)粒。已知大腸桿菌中導(dǎo)入了10個重組質(zhì)粒，且20分鐘分裂一次，但是不能確定細(xì)胞分裂過程中重組質(zhì)粒是否都復(fù)制，且是否平均分配到子細(xì)胞中去，因此不能確定1小時(shí)后可從1個大腸桿菌的后代中得到重組質(zhì)粒的個數(shù)。

（3）根據(jù)鏈狀DNA兩端的箭頭和圖紋可知，切割其的限制酶是BglⅡ；切割后仍然具有卡拉霉素抗性基因，但是丟失了氨芐青霉素抗性基因，因此為了確認(rèn)畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入卡拉霉素以便篩選。根據(jù)圖形分析可知，15個酵母菌中有2個是畢轉(zhuǎn)化成功的赤酵母菌，因此若要獲得16個成功導(dǎo)入該基因的酵母菌菌落，則上圖中的酵母菌菌落數(shù)至少要為15÷2×16=120個。

（4）已知質(zhì)粒在細(xì)胞傳代過程中有丟失現(xiàn)象，而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性高于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，說明目的基因整合到了酵母染色體上，不易丟失。