Question

如圖所示組織型纖維酶原激活劑（tPA）的生產(chǎn)過(guò)程．二氫葉酸還原酶（DHFR）能催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，缺少該酶的倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞不能合成四氫葉酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)入DHFR基因的缺失型細(xì)胞可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)．葉酸的類似物氨甲喋呤存在時(shí)，可與葉酸競(jìng)爭(zhēng)DHFR并抑制它的活性，使細(xì)胞死亡．當(dāng)DHFR基因大量擴(kuò)增并表達(dá)時(shí)，氨甲喋呤不足以結(jié)合全部的DHFR，細(xì)胞能在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基中存活．請(qǐng)回答：
（1）圖中HindⅢ和EcoRⅠ示兩種限制酶的酶切位點(diǎn)，將組織型纖維酶原激活劑（tPA）基因插入載體時(shí)，用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制酶同時(shí)切

 

，與只使用EcoRⅠ一種限制酶相比，其優(yōu)點(diǎn)是可以防止

 

．同時(shí)，在酶切的反應(yīng)體系中加入

 

酶，即可得到

 

．
（2）已知HindⅢ酶的識(shí)別序列是AAGCTT，酶切位點(diǎn)在AA之間，請(qǐng)寫(xiě)出此酶切割后的粘性末端：

 

（3）載體上的DHFR基因在基因工程中稱為

 

，1號(hào)培養(yǎng)基中不應(yīng)該加入

 

，2號(hào)培養(yǎng)基中應(yīng)該加入

 

，1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基在功能上屬于

 

培養(yǎng)基．
（4）在2號(hào)培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞還需進(jìn)行

 

活性的檢測(cè)，才能大規(guī)模培養(yǎng)以獲得相應(yīng)的產(chǎn)品．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的原理及技術(shù)

專題：

分析：1．在切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)，一定要使用同一種限制性內(nèi)切酶，這樣，切出的切口才一樣，才能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)連接起來(lái)．兩個(gè)黏性末端只要一樣就可以進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，再通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái)．
2．選擇性培養(yǎng)基是指根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基．其功能是使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌，從而提高該菌的篩選效率．

解答： 解：（1）在切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)，一定要使用同一種限制性內(nèi)切酶，這樣，切出的切口才一樣，才能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)連接起來(lái)．兩個(gè)黏性末端只要一樣就可以進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，再通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái)，形成重組質(zhì)粒．只使用EcoRⅠ一種限制酶切割的話可能目的基因和運(yùn)載體產(chǎn)生的兩端末端是相同的，會(huì)引起質(zhì)粒或tPA基因（載體或目的基因）自身連接．
 （2）已知HindⅢ酶的識(shí)別序列是AAGCTT，酶切位點(diǎn)在AA之間，請(qǐng)寫(xiě)出此酶切割后的粘性末端  
 （3）轉(zhuǎn)入DHFR基因的缺失型細(xì)胞可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)．葉酸的類似物氨甲喋呤存在時(shí)，可與葉酸競(jìng)爭(zhēng)DHFR并抑制它的活性，使細(xì)胞死亡．當(dāng)DHFR基因大量擴(kuò)增并表達(dá)時(shí)，氨甲喋呤不足以結(jié)合全部的DHFR，細(xì)胞能在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基中存活．可推出載體上的DHFR基因可作為標(biāo)記基因．轉(zhuǎn)入DHFR基因的缺失型細(xì)胞可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，故1號(hào)培養(yǎng)基中不應(yīng)該加入胸苷、甘氨酸、嘌呤．當(dāng)DHFR基因大量擴(kuò)增并表達(dá)時(shí)，氨甲喋呤不足以結(jié)合全部的DHFR，細(xì)胞能在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基中存活，故2號(hào)培養(yǎng)基中應(yīng)該加入氨甲喋呤．1和2號(hào)培養(yǎng)基都是選擇性培養(yǎng)基．
（4）在2號(hào)培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞雖能產(chǎn)生組織型纖維酶原激活劑，但不一定具有所需要的活性，因此還需要進(jìn)行篩選檢測(cè)，才能大規(guī)模培養(yǎng)以獲得相應(yīng)的產(chǎn)品．                                                                                       
故答案為：
（1）質(zhì)粒和tPA基因（質(zhì)粒和目的基因）    質(zhì)�；騮PA基因（載體或目的基因）自身連接    DNA連接    重組載體（重組DNA）
（2）-A    AGCTT-
-TTCGA     A-
（3）標(biāo)記基因    胸苷、甘氨酸、嘌呤    氨甲喋呤    選擇
（4）tPA（組織性纖維酶原活性劑）

點(diǎn)評(píng)：本題考查了基因工程的過(guò)程和微生物培養(yǎng)的相關(guān)內(nèi)容，意在考查考生識(shí)圖獲取有效信息的能力和理解所學(xué)知識(shí)的要點(diǎn)，把握知識(shí)間的內(nèi)在聯(lián)系的能力．