Question

生物柴油是一種可再生的清潔能源，其應用在一定程度上能夠減緩人類對化石燃料的消耗，科學家發(fā)現，在微生物M（單細胞）產生的脂肪酶作用下，植物油與甲醇反應能夠合成生物柴油（如圖1）．

（1）篩選產脂肪酶的微生物M時，選擇培養(yǎng)基中添加的植物油為微生物生長提供

 

，培養(yǎng)基滅菌采用的最適方法是

 

法．
（2）圖3是采用純化微生物M培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖．則獲得圖A效果的接種方法是

 

，圖B效果的接種方法是

 

．
（3）若需人工大量克隆脂肪酶基因，可應用

 

_技術，該過程需要的特殊酶是

 

．
（4）常用血球計數板（規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm）分兩類，一類是每個計數室包括16個中格，每個中格包括25個小格，這種計數板抽樣計數時只要統(tǒng)計四個頂角的中格即可；另一類是每個計數室包括25個中格，每個中格包括16個小格，這種計數板抽樣計數時除了統(tǒng)計四個頂角的中格外還要計數中央的一個中格．在實驗中如需定期測定培養(yǎng)液中微生物M的細胞數量，則在取出的樣液中要立即加入固定液，其目的是

 

．如果將樣液稀釋100倍，采用血球計數板計數時，觀察到的計數室中細胞分布如圖2所示，則培養(yǎng)液中微生物M的 細胞密度為

 

個/L．
（5）研究人員擬將某目的基因導入微生物M 細胞中，為此需要選擇合適的質粒作為運載體．圖4所示X-1、X-2、X-3、X-4為四種相關質粒，其中Tc^r表示抗四環(huán)素的抗性基因，Ap^r表示青霉素抗性基因，E1和E2表示兩種限制酶的識別位點．基因工程中限制酶作用的化學鍵是

 

．若將這四種質粒分別導入微生物M，然后將微生物M菌液分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)．則在這兩種培養(yǎng)基上均不能生長的M細胞類型有

 

．
（6）已知Tc^r長度為1.5kb（1kb=1000個堿基對），Ap^r長度為0.5kb．如果X-1用E1酶切，產生0.5kb堿基片段和8.5kb堿基片段，那么質粒X-2用E2酶切后的片段長度為

 

對堿基

Answer 1

考點：利用微生物進行發(fā)酵來生產特定的產物,基因工程的原理及技術

專題：

分析：分析題圖：圖1表示在微生物M（單細胞）產生的脂肪酶作用下，植物油與甲醇反應能夠合成生物柴油．圖2表示用血球計數板定期測定培養(yǎng)液中微生物M的細胞數量．圖3表示采用純化微生物M培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，其中A采用的是稀釋涂布平板法，B采用的是平板劃線法．圖4中，X-1只含有青霉素抗性基因；X-2只含有四環(huán)素抗性基因；X-3不含有抗性基因；X-4含有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因．

解答： 解：（1）植物油由C、H、O三種元素構成，微生物通常以此作為碳源；培養(yǎng)基常規(guī)的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌．
（2）獲得圖A效果的接種方法是稀釋涂布平板法，圖B效果的接種方法是平板劃線法．
（3）基因的擴增通常采用PCR技術，需要耐熱DNA聚合酶．
（4）為了防止細胞因自身的增殖周期而影響計數效果，需要加入固定液殺死固定微生物M細胞．該血球計數板規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm，并且是25×16型的，可采用五點取樣法，即取四角和最中間的5個中方格（80個小方格）計數，并采取“數上線不數下線，數左線不數右線”的原則處理，共計數了酵母菌5+4+4+4+3=20個．計數室共分了400個小方格，其容積共有1mm×1mm×0.1mm=0.1mm³=1×10^-4mL，所以可以計算出1mL有酵母菌

20

80

×400×10⁴×100（稀釋的倍數）=10⁸個，則1L有酵母菌10⁸×1000=10¹¹個．
（5）基因工程中限制酶作用的化學鍵是磷酸二酯鍵，X-1用E2切可以在有青霉素的培養(yǎng)基上生長；X-2用E2切可以在有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長；X-3不含有抗性基因都不能生長；X-4用E1切可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，用E2切可以在有青霉素的培養(yǎng)基上生長．
（6）如果X-1用E1酶切，產生0.5kb堿基片段和8.5kb堿基片段，則總長為9Kb．當Ap^r長度為0.5kb，質�？傞L為9Kb，則Tc^r長度為1.5kb時，X-2總長為10Kb（1kb=1000個堿基對），即10000個對堿基．
故答案為：
（1）唯一碳源   高壓蒸汽滅菌   
（2）稀釋涂布平板法   平板劃線法
（3）PCR  耐熱DNA聚合酶   
（4）防止細胞因自身的增殖周期而影響計數效果，因此要殺死固定微生物M細胞      10¹¹
（5）磷酸二酯    無質粒細胞含X-3的細胞
（6）10000

點評：本題結合題圖，考查微生物的培養(yǎng)和分離、細胞工程、基因工程等相關知識，要求考生識記微生物培養(yǎng)和分離的內容，能根據題圖判斷相應的接種方法；掌握血球計數板的計數原則，能進行簡單的換算；識記基因工程的技術和原理，能正確分析圖4，解答第（5）和（6）題．