Question

5．基因工程
pUC18是基因工程中常用的質(zhì)粒運(yùn)載體，其結(jié)構(gòu)如圖1（其中HindⅢ、PstⅠ、EcoRⅠ等限制酶的識(shí)別位點(diǎn)之間的堿基對(duì)數(shù)忽略不計(jì)，lacZ是顯色基因）．

現(xiàn)將擴(kuò)增的含目的基因的外源DNA片段與pUC18質(zhì)粒都用PstI進(jìn)行酶切，然后用DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒．為篩選非重組子和重組子，分別用不同的限制酶進(jìn)行酶切．經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1（1kb=1000對(duì)堿基）．請(qǐng)據(jù)圖分析回答：
（1）與pUC18質(zhì)粒重組的目的基因大小為4kb．
（2）用kpnⅠ酶切pUC18質(zhì)粒，產(chǎn)生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)（圖2）．下列說法中合理的是AC（多選）
A．重組質(zhì)粒中有兩個(gè)kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個(gè)位于目的基因的區(qū)段
B．重組質(zhì)粒中有兩個(gè)kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，都位于目的基因的區(qū)段
C．產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測(cè)是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時(shí)有兩種可能的插入方向
D．產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測(cè)是另有一種限制酶的酶切位點(diǎn)的堿基序列與kpnⅠ相同
（3）請(qǐng)?jiān)谀康幕�因上�?biāo)注kpnⅠ酶切位點(diǎn)（需注明目的基因的堿基對(duì)數(shù)量及kpnⅠ酶切位點(diǎn)兩側(cè)的堿基對(duì)數(shù)量）

（4）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達(dá)出β-半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落．反之，則形成白色菌落．選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加X-gal、IPTG、氨芐青霉素入物質(zhì)．成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成白色顏色的菌落，原因是lacZ基因被插入目的基因而失活．

Answer 1

分析 分析題圖：用HindⅢ或EcoRⅠ切割后，pUC18質(zhì)粒只產(chǎn)生1條2、7kb的帶，重組子產(chǎn)生了2條帶，即4.0kb和2.7kb，非重組子產(chǎn)生1條帶，即2.7kb．用kpnⅠ酶切pUC18質(zhì)粒，產(chǎn)生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，說明重組質(zhì)粒中有兩個(gè)kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個(gè)位于目的基因的區(qū)段，產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果的原因可能是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時(shí)有兩種可能的插入方向．據(jù)此答題．

解答 解：（1）根據(jù)圖1可知，pUC18質(zhì)粒的長(zhǎng)度是2.7kb，而重組子的長(zhǎng)度是2.7+4.0=6.7kb，因此與pUC18質(zhì)粒重組的目的基因大小為4kb．
（2）AB、pUC18質(zhì)粒的長(zhǎng)度是2.7kb，目的基因大小為4kb，用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，這說明重組質(zhì)粒中有兩個(gè)kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個(gè)位于目的基因的區(qū)段，A正確，B錯(cuò)誤；
CD、產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測(cè)是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時(shí)有兩種可能的插入方向，C正確，D錯(cuò)誤．
故選：AC．
（3）用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，說明重組質(zhì)粒中有兩個(gè)kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個(gè)位于目的基因的區(qū)段，目的基因上標(biāo)注kpnⅠ酶切位點(diǎn)如圖：．
（4）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達(dá)出β-半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落．反之，則形成白色菌落．培養(yǎng)基中應(yīng)含有大腸桿菌必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、水和生長(zhǎng)因子．由于質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌能抗氨芐青霉素，所以培養(yǎng)基中還應(yīng)加入氨芐青霉素，作用是篩選出導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌，此外培養(yǎng)基中還應(yīng)加入IPTG、X-gal．重組質(zhì)粒上的LacZ基因被破壞，不能產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，若大腸桿菌中已成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，則其在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基中形成白色菌落．
故答案為：
（1）4
（2）AC
（3）

（必須正確標(biāo)出酶切位點(diǎn)距離一端的堿基數(shù)才給分，也可標(biāo)于左側(cè)．）
（4）X-gal、IPTG、氨芐青霉素    白色    lacZ基因被插入目的基因而失活

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)問題，能正確分析題圖，并結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱識(shí)記和理解層次的考查．