發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法在檢測(cè)生物毒性的方法中具有靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)而被廣泛采用.
實(shí)驗(yàn)原理:細(xì)菌代謝正常時(shí),發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定,并可維持較長(zhǎng)時(shí)間;當(dāng)外界環(huán)境影響到發(fā)光細(xì)菌代謝時(shí),發(fā)光會(huì)立即受到抑制,且抑制程度與影響物質(zhì)濃度大小呈相關(guān)關(guān)系.
實(shí)驗(yàn)材料:明亮發(fā)光桿菌(海水細(xì)菌)、待測(cè)海水水樣、2%的NaCl溶液、3%NaCl溶液、生物毒性測(cè)試儀(用于測(cè)定細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度)、全溫振蕩器、試管等.
Ⅰ.發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)
發(fā)光細(xì)菌可以直接從海水中和海魚的體表和內(nèi)臟中分離,所采用的培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,甘油0.3%,KH
2PO
40.1%,Na
2HPO
40.5%,NaCI
3%,瓊脂2%,pH6.5.
(1)發(fā)光細(xì)菌為
(自養(yǎng)型/異養(yǎng)型).取海魚內(nèi)臟放入滅菌培養(yǎng)皿中20℃培養(yǎng)12-18小時(shí),在暗室中尋找發(fā)光點(diǎn),用
刮取少許菌苔,在
培養(yǎng)基中采用
法獲得純化的發(fā)光菌株.使用前接種到
培養(yǎng)基中20℃下振蕩培養(yǎng)10-12小時(shí),增殖后用磷酸緩沖液稀釋后備用.
Ⅱ.海水中重金屬污染程度測(cè)定
a、配制發(fā)光菌懸液;
b、抑光反應(yīng):按照下表配置海水樣品稀釋液;
表1海水中重金屬污染程度測(cè)定
試管編號(hào) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
3%NaCl溶液(mL) |
|
4.74 |
4.49 |
4.24 |
3.99 |
海水樣品(mL) |
|
0.25 |
0.50 |
0.75 |
1.00 |
發(fā)光菌懸液(mL) |
|
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
混合液中海水濃度(%) |
|
0.05 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
(2)表1中1號(hào)試管的作用是
.
(3)請(qǐng)?jiān)诒砀裰刑顚戇m當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù).
(4)利用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定各試管的
(測(cè)定指標(biāo)).
Ⅲ.五氯酚鈉毒性測(cè)定
資料:五氯酚鈉在水中以五氯苯酚陰離子和五氯苯酚分子平衡存在;五氯苯酚比五氯酚鈉的極性小得多,更容易通過生物膜而與細(xì)菌細(xì)胞相接觸.實(shí)驗(yàn)溫度25℃下,pH為6.0、7.0、8.0、9.0時(shí),pH每升高1個(gè)單位,分子態(tài)五氯苯酚所占的比例就下降一個(gè)數(shù)量級(jí).
a、將五氯酚鈉配成5個(gè)左右濃度等級(jí),將接種后12h的菌液1-2mL用20-30mL3%NaCl溶液稀釋混合,磁力攪拌10min 后,?取0.2mL加入比色管中,上下振蕩5次,去塞,靜置15min后用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度.
b、計(jì)算相對(duì)發(fā)光率
相對(duì)發(fā)光率(RL)=測(cè)試管發(fā)光量mV/對(duì)照管發(fā)光量mV×100%
計(jì)算對(duì)應(yīng)相對(duì)發(fā)光率減小50%的物質(zhì)濃度(EC50)??
c.不同pH條件下,五氯酚鈉毒性測(cè)定
發(fā)光細(xì)菌適宜生存的pH值為6.0-9.0
?表2 不同pΗ 值下五氯酚鈉毒性測(cè)定結(jié)果/㎎?L
-1
pΗ |
6.0 |
7.0 |
8.0 |
9.0 |
EC50值 |
1.74 |
2.41 |
9.39 |
15.94 |
(5)表2的結(jié)果與結(jié)論
.
(6)據(jù)資料分析可能的原因:
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